细胞内记录技术和细胞外记录技术

二、细胞内记录 技术和细胞外记录技术

细胞内记录（intracellular　record）和细胞外记录（extracellular　record）技术是在神经、肌和腺体等可兴奋组织或细胞的电生理实验和研究中常用的两种技术，在组织离体和在体的条件下均可应用。细胞内记录是由Ling在1948年研制出尖端直径小于1μm的玻璃微电极后建立起来的，通过几十年的发展，该技术已趋于完善。在这个过程中，某些生理学难题如可兴奋细胞在安静和兴奋时膜内外的电位变化等得到了彻底的解决。细胞外记录虽然方法较为古老，但技术难度较细胞内记录要小，在早期的一些生理学知识的产生和发展中起到重要的作用，现仍应用于生理学实验教学与科学研究之中。

（一）细胞内记录和细胞外记录技术

1．细胞内记录技术　应用细胞内记录技术，可探测到细胞膜内外电位差的变化。Hodgkin等在1949年采用细胞内记录的标本是枪乌贼的单根巨轴突，他们发现神经纤维的动作电位和超射，同时提出膜电位的钠离子学说。随后该技术扩展到对单个的骨骼肌细胞、心肌细胞和脑细胞的电活动发生机制及影响因素的研究。该记录方法是用一金属或玻璃管制成尖端直径只有1μm或更小（可小于0．5μm）的微电极（microelectrode），玻璃微电极尖端和管内充满KCl溶液，并将一根银－氯化银引导电极插入其内。电极插入细胞的膜内后，测量其在安静或受刺激时膜内和另一固定于膜外的参考电极之间的电位差。这样记录到的电位差变化就只与该细胞的电变化有关，而不会受到相邻的其他细胞电变化的影响，对所得结果就易于进行分析。记录电极在膜内，参考电极在膜外，膜内到膜外由于存在着微电极与细胞膜之间的封接电阻（这种封接电阻在普通玻璃微电极可达50MΩ），故可避免短路的影响而获得准确的跨膜电位数值。加之微电极的尖端直径很小，插入细胞内不会对细胞膜造成明显的损伤，对其兴奋性和传导性亦不会引起明显的影响。用细胞内记录技术，能较真实记录可兴奋细胞在安静状态下和受刺激而发生兴奋时存在于膜内外的电位差及其变化。

2．细胞外记录技术　有些神经纤维过于纤细，即使用微电极也难以插入，甚至插入后神经纤维会受到明显的损伤而影响其正常的兴奋性，在这种情况下就必须用细胞外记录。另外，在研究中枢神经系统的电位变化时，由于神经细胞间有一定的距离，用微电极穿刺细胞比较困难，也只能用细胞外记录技术记录其单位放电。细胞外记录反映的是在动作电位传播过程中细胞膜外两个引导电极之间的电位差变化。

神经干动作电位（action　potential）引导的实验就是细胞外记录的一个典型例子。在实验中记录到的是许多根神经纤维的动作电位通过两个记录电极时的相对电位变化，呈双向性。但若把在两个记录电极之间的神经纤维预先用普鲁卡因阻断，兴奋时的电位变化就不能从前一个电极传至后一个电极，亦可记录到单相动作电位。神经干由许多纤维组成，其兴奋性不尽相同，故在一定范围内随刺激的强度增大，动作电位的振幅亦增大；由于记录到的是一种复合动作电位（compound　action　potential），故电位变化常互相干扰，图形较为复杂而不易分析；加之各神经纤维均有较厚的结缔组织，其中都包含有导电的组织液，在神经干标本制成后又用溶液浸泡，虽然在引导电位前用滤纸吸去表面液体，但在神经纤维膜外也会形成一个低电阻的短路，故给予阈上刺激使之发生兴奋，电流通过时便会形成一个分路，从而减少了实际电位的数值，测得的电位较细胞内记录的要小得多。

（二）细胞内记录和细胞外记录技术的应用

细胞内记录和细胞外记录技术在生理学的研究中应用非常广泛，以下仅介绍这两种技术在神经和心肌细胞电活动研究中的应用及所得结果的差异。

1．单根神经纤维和神经干的电位变化测定　在生理学中，把刺激的持续时间保持一致时，引起组织发生反应的或引起可兴奋细胞（神经、肌和腺体）产生动作电位的最小刺激强度称为阈刺激（threshold　stimulus），通常称为阈值。大于或小于阈刺激强度的刺激分别称为阈上或阈下刺激。

用细胞内记录技术记录单根神经纤维膜内外的电位变化时可观察到以下变化：用阈下刺激不能使之产生动作电位；只要刺激的强度达阈值和该纤维处于正常的反应期，就会记录到动作电位；只要纤维的直径和代谢水平一致，刺激强度达阈值即可记录到动作电位，且动作电位的振幅不再随刺激强度的增加而增大。这种单个可兴奋细胞在阈下刺激时不产生动作电位，刺激达阈值后产生动作电位且动作电位的振幅不再随刺激强度的增加而增大的特性，称为“全或无”定律（all－or－none　law）。

神经干是由无数结构和功能独立的神经纤维组成，纤维的粗细不等和兴奋性不同，因此，引起这些纤维产生动作电位的阈值存在很大的差异。用细胞外记录技术记录神经干的动作电位时可观察到以下变化：当刺激强度很小时，所有的纤维都不发生兴奋，记录不到动作电位；刺激强度达到一定时，兴奋性最高的纤维兴奋，可记录到振幅很小的动作电位；在此基础上，随刺激强度不断增加，发生兴奋的神经纤维数量逐渐增多，动作电位的振幅亦不断增大；当刺激强度增加到使所有的纤维都兴奋时，动作电位的振幅达最大，即不遵循“全或无”定律（表1－1）。

2．心表电图和单个心肌细胞动作电位的测定　将麻醉兔胸骨正中开胸暴露心脏，去心包，38℃生理盐溶液保持心外膜湿润。用两支银丝做成直径为1．0mm球形接触电极（contact electrode）触及心室外膜的两点；另用一尖端直径小于0．5μm的悬浮式微电极插入单个心室肌细胞内，参考电极置心外膜。分别将信号引入计算机，就可记录到心外膜的表面电图（surface　electrocardiogram）和心肌细胞的动作电位（图1－3）。

心表电图同体表心电图的形态和时限一致，与单个细胞的跨膜电位（transmembrane　potential）比较，二者具有以下差异。

（1）心表电图是用细胞外电极记录，反映体表二点间（兴奋部位和未兴奋部位，复极部位和未复极部位）的电位差。细胞的动作电位是用细胞内微电极记录的，微电极插入到细胞内，另一个电极置于细胞表面，测得的电变化反映兴奋时膜内外的电位差。

（2）心表电图反映的是整个心脏在一个心动周期中的电变化，它是心肌细胞群电活动的综合反映，电极放置的部位不同，心表电图波形不一样。心肌细胞跨膜电位反映的是细胞在静息时和兴奋时膜内外的电位变化，在不同部位心室肌细胞内记录的动作电位波形差异较小。

（3）心表电图的ST段和TP段，均表现为等电线，不能反映心肌的极化状态，亦无反极化的电位变化。心肌细胞跨膜电位能反映膜内外的极化和反极化的状态（0相反映的是去极化和反极化，4相反映的是极化状态）。

综上所述，细胞内记录和细胞外记录是各自独立的两种技术，其获得的结果相互补充，使体内某些生命活动的现象和过程在不同角度和程度得到合理的解释或阐明。因此，这两种技术在电生理实验和研究中都具有同等重要的作用和地位。