寄生虫基因组与功能基础研究

第一节 寄生虫基因组与功能基础研究

一、寄生虫基因组计划

一个物种基因组信息的展现、发掘和解读为人们认识其生命活动的规律，了解物种－物种及物种－环境之间的相互关系提供了新的视角和丰富的资源。WHO自1994年启动了寄生虫基因组计划，覆盖了包括疟原虫、血吸虫、锥虫、丝虫和利什曼原虫在内的重要人体寄生虫，主要包括以下几个目标：①获得寄生虫基因组的物理图谱；②分析、整合并共享基因组数据；③加深对寄生虫分子生物学的认识，特别是抗药机制、抗原变异及遗传多样性方面；④鉴定新的药物靶标、诊断分子及疫苗蛋白。随着基因组测序技术的不断优化及成本的降低，不同研究机构陆续开展了寄生虫基因组的测序工作。迄今已有与疟疾相关的疟原虫、血吸虫病相关的3种主要的血吸虫等寄生虫的全基因组序列信息。其他如利什曼原虫、布氏锥虫、刚地弓形虫、蓝氏贾第鞭毛虫、溶组织内阿米巴、马来布鲁丝虫、美洲板口线虫、伯氏疟原虫和约氏疟原虫等10余种寄生虫种系均已开展类似的基因组研究，正在日益显示出其巨大的研究价值。

二、寄生虫基因组特点

寄生虫涉及的物种范围较广，横跨原生动物门、扁形动物门、线形动物门、软体动物门及节肢动物门。因此，相对于高等的脊椎动物，寄生虫基因组除了核（染色体）DNA和线粒体（mitochondrian）DNA之外，还有动基体（kinetoplast）DNA和质体（plastid）DNA。

1.核基因组

寄生虫染色体基因组大小随物种不同而呈现明显的差别，如表3－1所示，疟原虫仅为22Mb，而肝片吸虫（Fasciola hepatica）高达1.275Gb。甚至有些寄生虫同种之间染色体的大小和数目也变化很大，如两株布氏锥虫的分子核型也会不一样。多数寄生虫基因组中碱基G/C含量在30％～40％，但利什曼原虫的G/C含量高达57％，且编码区比非编码区的G/C含量高，3′－UTR比5′－UTR的G/C含量高；而阿米巴原虫和疟原虫基因组则富含AT，如恶性疟原虫第2～3号染色体编码区的A/T含量在74％，非编码区则高达84％～92％。这可能是疟原虫基因组不稳定性的原因之一。一些寄生虫核基因组的多态性较高，如利什曼原虫种内、种间染色体多态性程度相当高。这种多态性大多是由于染色体大小改变所致。而且同源染色体大小的改变不仅发生在种间，也发生在种内不同克隆株间。除了标准染色体外，利什曼原虫在多拷贝的微小染色体上还载有另外的遗传物质。微小染色体可以自发发生，也可能是暴露于不良环境中引起的基因组扩增的结果。基因扩增在利什曼原虫经常发生，可能是应对药物选择、营养压力选择的结果。微孢子虫的基因多态性也非常显著，表现在核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）呈多态性，不同虫种间差异明显；ITS间的重复序列的多态性；核型及染色体数目的多态性；染色体数目和核型条带各异。

2.线粒体基因组 线粒体在真核生物中广泛存在，具有独立的基因组，其长度为14～20 kb的环状DNA分子，含有编码区和非编码区。由于线粒体DNA具有母系遗传和快速进化的特点，较核染色体DNA更易反映种、株乃至型间的差异，因此通常被用来评价物种的种系发生。目前已有多种寄生虫的线粒体基因组序列信息，相应的寄生虫种系分析及进化分析研究正在开展。

3.动基体基因组 动基体存在于利什曼原虫、锥虫中，是一种特化了的线粒体。每个动基体拥有单个动基体DNA（kinetoplast DNA，kDNA），由成千上万拷贝的小型环状DNA与拷贝数较少的大型环状DNA互相连环形成的有高度组织结构的盘状网络。动基体的大环相当于其他真核生物体的线粒体，而小环被转录成导向RNA（guide RNA，g DNA）。利什曼原虫kDNA大环蛋白编码基因的表达是极其复杂的，它们转录子的大部分必须进行转录后修饰——RNA编辑，从而矫正阅读框的移码，产生可翻译的m RNA。而利什曼原虫的小环DNA序列高度一致性的特征可以用于区分利什曼虫种、亚种，甚至最终用于临床诊断利什曼病。

4.质体DNA（apicoplast，plastid DNA） 质体是由4层膜质包围的含有DNA的独特细胞器。迄今为止在包括疟原虫、弓形虫、巴贝虫和艾美尔球虫等多种顶器复合门原虫中都发现了这种细胞器。质体DNA呈闭合环状，在疟原虫和弓形虫中的大小约为35kb。序列比较发现，质体DNA与藻类植物的叶绿体DNA具有较高的同源性，但质体基因组已经丢失了进行光合作用的基因，只保留了RNA聚合酶亚单位、核糖体RNA和tRNA的基因。

三、寄生虫基因组研究的应用(https://www.daowen.com)

1.认识寄生虫生物学特征的分子基础 寄生虫基因组信息的披露为认识其生长发育、营养、代谢、感染、免疫逃避等方面提供了新的视角。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的基因组研究表明，与自由生活的真核微生物相比，疟原虫有很大比例的基因与免疫逃避、宿主－寄生虫互作相关。此外，疟原虫还存在哺乳动物所不具备的类异戊二烯代谢途径。布氏锥虫（Trypanosoma brucei）基因组包含806个以上的变异表面糖蛋白（variant surface glycoprotein，VSG）基因，这些基因与逃避宿主的免疫相关。日本血吸虫的基因组研究发现了与感染宿主密切相关的弹性蛋白酶（elastase），该蛋白能够消化宿主的皮肤组织从而有助于虫体侵染机体。血吸虫还会编码一些炎症相关分子，如前列腺素、多聚糖、脂质、自身抗原样蛋白等，这些因子可诱导宿主免疫反应，导致严重的血吸虫病。此外，血吸虫编码一些与宿主内分泌基因高度同源的基因，如胰岛素类生长因子受体，纤维原生长因子受体，表皮生长因子受体，生长激素受体，雄/雌激素受体等，说明血吸虫的生长、发育和成熟与宿主密切相关，既可利用自身的，同时也可以利用宿主的生长因子或生长激素来维持其生命活动。绦虫基因组的研究发现，除了明显的基因及通路丢失之外，绦虫具有特殊的解毒通路及营养物质回收机制。这些研究为认识寄生虫的生物学特征、开发药物及研制疫苗奠定了理论基础。

2.比较基因组学研究 比较基因组学拓宽了分子寄生虫学和分子进化等研究领域。Peacock等比较了3种利什曼原虫（Leishmania major，L.infantum和L.braziliensis）的全基因组差异，从中鉴定到了78个种特异的基因，其中一些基因可能与3种病原致病性的差异相关。Young等比较了3种血吸虫的全基因组，结果显示曼氏血吸虫和埃及血吸虫的基因组最为相近，支持进化上所认为的日本血吸虫更为古老的观点。通过与人、线虫、果蝇和蚊等进行比较分析发现，血吸虫与人的关系更为密切，揭示血吸虫对其寄生终宿主有着适应和利用的共同进化关系（co－evolution）。此外，线粒体基因组序列已广泛应用在系统发育学的分析中。如，血吸虫线粒体基因序列分析表明，血吸虫在亚洲发展然后向西传播到非洲，最近有关血吸虫分子进化史的研究支持这一新假说。

四、寄生虫基因组研究面临的挑战

全基因组测序在寄生虫领域是一场重大的革命，多种寄生虫基因组数据的释放为寄生虫病的研究提供了大量序列信息，拓宽了我们对寄生分子生物学的认识。然而，在寄生虫基因组研究领域，仍然面临如下的挑战。

1.基因组注释 首先，由于全基因组测序的昂贵及基因组序列的复杂性，因此测序的结果在未来数年内都是不可重复的，更不可能被实验一一验证。比如，疟原虫基因组数据发布时，仅有不到基因组数据1％～2％的序列被实验验证。并且自该基因组数据释放以来，后续几乎没有进行相关的序列验证。鉴于基因组及相关的转录组和蛋白组测序提供了大量的复杂性数据，因此如何充分地分析和利用这些数据面临着巨大的挑战。其次，预测编码基因在基因组中的位置及定义基因的功能并不容易，有时候甚至很难完成。例如，疟原虫基因组中非常规的AT组分就不适合作为基因预测的算法，因为该算法是针对像人和小鼠这样富含GC的基因序列的预测的。而且从某种角度来说，基因组测序为我们提供了更多不明确的信息。以疟原虫为例，在基因组数据释放之前，50～100个的基因已经被详细描述过，明确与入侵、免疫逃避、次生代谢（intermediary metabolism）、细胞黏附或者对宿主细胞的修饰等过程相关。而基因组测序却仅在整体上进行了描述，如预测了5 200多个开放读码框架（ORF），发现其中60％左右序列与其他物种明确功能的基因没有相似性；列举了一些蛋白家族（reticulocyte binding protein，RBP；erythrocyte binding antigens，EBAs）的新的未知成员，这仍需要很长的时间去理解它们的功能。

尽管对基因组测序的结果和分析还有大量数据未被确证或审查，但是不能否认的是基因组序列为人们提供了一个难以置信的广阔的有关探讨寄生虫生物学和怎样防治寄生虫的新的领域。为进一步理解和挖掘基因组信息，需要进一步的开发生物信息学的分析方法、提升预测的准确性。

2.功能基因研究 基因组测序及生物信息学分析为我们提供了很多候选的靶基因，但是要理解这些基因的功能，仅靠生物学预测是不够的，还需要开展一系列的功能研究。目前常用的功能研究方法主要有RNA干扰（RNAi）和转基因（transgenesis）等技术。在寄生原虫中，这些技术的应用较为成熟，而在后生动物门的寄生虫中，这些分子操作手段却并不那么有效。

RNA干扰是目前广泛使用的基因沉默技术，已经在多种生物中成功应用。该技术对寄生虫的功能研究至关重要。一方面它可以帮助筛选关键的基因进而确认可能的药靶，另一方面它可以研究那些不能注释功能的基因。近些年来，很多研究组试图将该技术应用到寄生蠕虫领域。然而，目前仅在马来丝虫（Brugia malayi）、巴西钩虫、血吸虫等少数几种寄生虫中获得成功应用。转基因技术也是目前广泛使用的功能研究手段，可以进行基因重组、调控基因表达水平。在寄生虫中，目前没有稳定的可遗传的转基因应用，但是可以进行DNA的导入及表达操作。为了使转基因技术在寄生虫中广泛应用，还需要克服以下几个技术问题：①能够在生殖系统中进行基因转化；②能够将外源DNA整合到染色体DNA中；③开发高通量的方法筛选转化的子代。值得注意的是，最近热门的CRISPR基因组编辑技术已经成功地在恶性疟原虫中得到应用，但是在其他的寄生虫中尚未见报告。此外，目前也没有可用的寄生虫细胞系，极大地限制了寄生虫的生化及分子研究。综合而言，由于寄生虫复杂的生活史及多样化的组织分布，且多数不能在体外正常的培育，使得功能基因操作技术更难于应用。

3.转化应用 寄生虫基因组测序及功能基因组学研究的最终目的是应用于临床检测及治疗，从而达到消除寄生虫病的目的。这种从基础研究到临床应用的转化过程，称为转化医学。目前转化医学普遍存在转化效率低的问题，从药靶的发现到新药的获得平均周期约为13年，而失败率超过95％。目前寄生虫基因组研究的快速发展为转化应用提供了机遇，也带来了巨大的挑战。一方面基因组数据可以帮助我们理解基因与表型、疾病发生发展的机制；另一方面大量的生物标记物亟须验证是否可以作为治疗及预防的靶点。为了使寄生虫基因组数据充分的转化应用，应该从以下几个方面着手：①密切联系临床的需求，重点转化与临床检测及治疗相关的生物标志物，提高转化效率；②建立多学科交叉的研究联合体，建立从基础研究到临床应用的快速转化体系。

（胡 薇）