组织形态学观察

1.HE染色 Sakai等［7］在模型建立后，通过HE染色对其模型的建立进行评估，并采用Nishimura和Mochida的椎间盘退变分级系统对其退变程度进行评价，HE染色结果表明Group C的椎间盘呈轻度退变 (平均级别：4周，0.17±0.09；8周，0.28±0.10；12周，0.44±0.16)；Group D的椎间盘呈进展性退变 (平均级别：4周，2.55±0.12；8周，3.66±0.11；12周，4.11±0.07)；而Group S的椎间盘呈严重退变 (平均级别：4周，3.28±0.10；8周，4.39±0.11；12周，5±0)(图6-4)。另外，Yang等［8］采用31G针头在显微镜下对小鼠尾椎间盘进行针刺来建立椎间盘模型，也通过HE染色完成椎间盘组织形态学观察，并采用改良的椎间盘退变分级系统 (表6-1)，发现在术后1周，小鼠椎间盘的纤维环出现中度的裂纹，细胞排列混乱，髓核中细胞密度下降；而术后2周，纤维环呈折叠状，并在纤维环和髓核的连接处出现软骨样变细胞；在12周时，可观察到纤维环结构出现纤维化及裂缝，髓核与纤维环边界清楚 (图6-5，图6-6)。

图6-4　各组椎间盘环形固定4周、8周、12周后的HE染色结果

［本图引自Sakai D，et al.Spine J，2015，15(6)：1356-65.］

表6-1　改良的椎间盘退变分级系统

续表

［本表引自Yang F，et al.JPathol，2009，218(1)：113-21.］

图6-5　小鼠椎间盘的形态学改变

A.正常小鼠椎间盘显示髓核组织和纤维环的截面；B.外层纤维环，箭头示成纤维细胞样细胞；C.内层纤维环，箭头示软骨细胞；D.髓核，三角示脊索细胞，箭头示软骨样细胞；E-I.从手术前到12周后的椎间盘形态变化；J-N.从手术前到12周后的纤维环；O-S.从手术前到12周后的髓核。［本图引自Yang F，et al.JPathol，2009，218(1)：113-21.］

图6-6　各时间点椎间盘退变组织学评分

［本图引自Yang F，et al.JPathol，2009，218(1)：113-21.］

2.TUNEL染色 Lotz等［3］利用外部压缩装置在小鼠尾部椎间盘给予不同负载作用不同的时间后，经DNA断端末端标记 (TUNEL)法检测发现持续脊柱非生理性负载造成椎间盘细胞的死亡，且凋亡细胞的数量随负载强度和时间的增加而增加 (图6-7)。

图6-7　小鼠尾部椎间盘给予不同负载作用不同时间后的TUNEL染色结果

在低负载短时间压力下，凋亡细胞主要出现在内层纤维环及软骨终板，在高负载长时间压力下凋亡细胞在髓核中广泛存在。［本图引自Lotz JC，et al.Spine(Phila Pa 1976)，2000，25(12)：1477-83.］

3.Alcian Blue/Picrosirius Red染色 Martin等［9］通过粗针头(26G)、细针头 (29G)对椎间盘进行针刺造模，采用 Alcian Blue/Picrosirius Red染色对其椎间盘结构进行观察，发现粗针头(26G)针刺造模8周后椎间盘出现高度下降，阳性染色的胶原排列紊乱；此外，在髓核中GAG染色阳性缺乏 (图6-8)。

图6-8　各组椎间盘针刺8周后Alcian Blue/Picrosirius Red染色结果

［本图引自Martin JT，et al.JOrthop Res，2013，31(8)：1276-82.］

4.Safranin-O染色 Court等［6］通过固定小鼠第9、第10尾椎造成异常力学负载1周的方法建立小鼠椎间盘退变的模型，通过Safranin-O染色的方法来表明椎间盘退变的情况，他们发现弯曲装置移除三周后凹侧的中、外胶原层部分细胞丢失。此外，凹侧内层中的剩余细胞多为圆形 (部分多核)，类似于软骨细胞 (图6-9)。此外，Lawrence M.Boyd等［10］在小鼠Col9αl基因敲除后3月龄、6月龄、12月龄时对其椎间盘组织进行Safranin-O染色，发现3月龄、6月龄时椎间盘区域软骨细胞的增殖及黏液变性，而在12月龄时出现软骨结构紊乱、终板破坏及下终板硬化/钙化(图6-10)。Sakai等［7］报道的新型椎间盘退变的应力改变模型中，Safranin-O染色发现Group C的椎间盘髓核中糖胺聚糖呈强阳性，Group D的椎间盘髓核中糖胺聚糖阳性较弱，而在Group S 12周后椎间盘髓核中未发现明显阳性 (图6-11)。(https://www.daowen.com)

图6-9　正常组 （A，B）与负载组 （C，D）的椎间盘凹侧的Safranin-O染色结果

负载移除后3周在椎体边缘出现成纤维细胞增殖 (P)，而在内层纤维环中出现软骨样细胞(CLC)(D)。［本图引自Court C，et al.Eur Spine J，2007，16(11)：1899-906.］

图6-10　Col9al基因敲除小鼠3月龄 （A）、6月龄 （B）、9月龄 （C）时椎间盘Safranin O-fast green染色结果

［本图引自Boyd LM，et al.Arthritis Rheum，2008，58(1)：164-71.］