1.3.1 甲烷化代谢途径的研究方法
目前，用于分析甲烷生成途径的方法主要包括三类：①采用甲烷化抑制剂，如用溴乙烷磺酸盐（BES）完全抑制产甲烷[134，135]，或者用氟甲烷（CH3F）抑制乙酸发酵型产甲烷途径[136，137]，通过这些化学物质对某些代谢途径的特异性阻断作用来判别甲烷的生成途径；②稳定性同位素13C或放射性同位素14C标记法，如加入碳同位素标记的NaHCO3或乙酸，根据不同甲烷化途径中甲烷碳的来源不同，分析甲烷化代谢途径[65，71，138]；③天然稳定碳同位素指纹识别技术，根据不同甲烷化反应对稳定碳同位素分馏效应的差异，识别甲烷的产生途径[139-141]。其中，添加抑制剂的方法相对简单直接，但却会一定程度地影响微生物的活性，长期暴露于抑制物中亦可能对微生物产生驯化，因此使用时需小心控制使用剂量和培养时间[136]。在厌氧消化系统中运用稳定碳同位素标记和指纹识别技术，属于甲烷化代谢途径的创新研究方法，以下分别进行介绍。
1.人工稳定碳同位素标记技术
碳同位素标记技术是采用稳定性碳同位素（13C）或放射性碳同位素（14C）标记的底物对环境样品进行培养，然后通过监测标记物在底物和产物中的分布来判断物质代谢途径。该方法已被多次应用于厌氧生境中共生乙酸氧化途径对甲烷产生率的贡献的研究[71，76，142，143]。在乙酸氧化反应中，乙酸的羧基和甲基被共生乙酸氧化细菌转化为CO2和H2，50%的CO2又被产甲烷菌转化为甲烷。而在乙酸发酵型途径中，乙酸的甲基形成了甲烷，羧基则被转化为CO2。因此，根据甲烷中碳来源的差异，可定量分析其产生途径。如采用[2-13C]CH3COOH为底物时，乙酸发酵途径仅产生13CH4[式（1-1）]；而在共生乙酸氧化途径中，则能够产生13CH4和13CO2[式（1-2）和式（1-3）]。产物中标记物质的分布，可用于指示甲烷的形成途径。
在厌氧反应器中，常采用无机碳盐作为缓冲体系，外源性无机碳的添加会稀释共生乙酸氧化生成的CO2的浓度。倘若伴随着乙酸氧化发生的氢营养型甲烷化反应中消耗的CO2来源于体系中的无机碳，则外源性无机碳会对13CO2浓度形成“稀释效应”[143]；但氢营养型产甲烷菌也可能仅利用与其相邻的共生乙酸氧化细菌生成的CO2，则不存在“稀释效应”[142]。图1-6显示了“稀释效应”对标记物13CH4在产物中的分布差异。其中，假设初始状态下反应器中有100 mmol的13CH3COOH和100 mmol的溶解性无机碳（即“Backgroud CO2”）。反应过程中，假设50%的乙酸通过乙酸发酵型甲烷化途径降解，另50%通过共生乙酸氧化途径降解。可见，外源性无机碳的“稀释效应”对结果产生了显著影响。共生乙酸氧化途径中，氢营养型产甲烷菌的无机碳源是来自共生乙酸氧化反应还是整个反应体系目前尚无定论，因此，需同时采用乙酸碳标记和无机碳标记的方法进行验证。另外，因标记物和测试仪器造价昂贵，该方法仅适用于有限的小型反应体系和实验室研究。
图1-6 稳定碳同位素标记法中13CH4和12CH4的计算[143](https://www.daowen.com)
2.天然稳定碳同位素指纹识别技术
自然界中存在三种碳同位素，包括12C、稳定性同位素13C和放射性同位素14C。由于稳定同位素分子之间存在着物理与化学性质的差异，各种生物化学过程常常引起元素的同位素丰度涨落，造成稳定同位素在不同化合物或在不同物相间分布不均匀，通常把这种现象称为稳定同位素分馏。
甲烷化代谢过程中，由于产甲烷菌对12C的喜好，底物中的12C被优先转化为CH4，使得CH4中13C比值偏低[138]。三种产甲烷途径中均存在不同程度的稳定碳同位素分馏效应（图1-7）。附表A-1中列出了营不同代谢途径的部分产甲烷菌的稳定碳同位素分馏效应因子（α）。氢营养型和甲基营养型甲烷化代谢，是自然界中除甲基卤素氧化反应（α可达到1.070）外[144]，生物可产生最显著同位素分馏效应的生物化学过程；而乙酸发酵型产甲烷途径的同位素分馏效应则相对较弱。产物（CH4和CO2）中稳定碳同位素的分布，形成了各产甲烷途径的特征性指纹图谱。因此，通过分析底物和代谢产物中稳定碳同位素的变化，即可识别不同厌氧系统中甲烷生成的主导途径。其定量化计算方法见2.5.3章节。
图1-7 碳和稳定碳同位素比值在厌氧产甲烷过程中的变化[138]
天然稳定同位素指纹识别技术，可实现对甲烷化代谢途径的动态原位监测，目前已广泛应用于对稻田土壤和水稻根系[72，139，140，145]、湖泊[68，69，146，147]、湿地沼泽[148-150]微生物区系产甲烷途径的探测。Qu等人[75，141]则首次采用该技术，分析了生物可降解固体废物厌氧消化过程中甲烷化代谢途径的变化过程。
在应用该技术的过程中，往往由于仪器和反应体系的限制，难以对所有关键参数（如乙酸甲基的稳定碳同位素比值δac-methyl，以及各产甲烷反应的同位素分馏效应因子α，其他参数参考2.5.3节）同时准确测定。因此，仅能采用文献值（见附表A-1）对甲烷的生成途径进行大致判断。另外，在以外加乙酸为碳源的批式培养实验中，反应后期还存在底物中惰性元素13C富集的问题[151]，会导致同位素分馏效应因子偏移。所以，在将这些技术应用于新的反应体系时，需要进行方法的优化。