4.2.3 测试指标与方法
1.气相
参照2.2.1节。气相中δ13CH4和δ13CO2的测试方法参照2.3节。
2.液相
参照2.2.2章节。
3.固相
参照2.2.3章节。(https://www.daowen.com)
4.qPCR
DNA的提取参照本书第3.2.3.4章节。采用SYBR Green方法定量分析各微生物种群的丰度，包括甲烷杆菌目Methanobacteriales（MBT-set）、甲烷微菌目Methanomicrobiales（MMB-set）、甲烷鬃毛菌科Methanosaetaceae（Mst-set）、甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae（Mscset）、古菌Archaea（ARC-set）以及共生乙酸氧化细菌（FTHFS-set和ACSset）。qPCR中所使用的引物信息见表2-6。每个qPCR反应体系为20 μL，包括：10μL SYBR Premix Ex-Taq TM溶液（TaKaRa，Japan）、2 μL DNA模板溶液、引物溶液各0.4μL和7.2μL Milli-Q水。qPCR程序为：预变性94℃10 min；45个循环包括：变性94℃10 s，退火60℃（MMB-set使用63℃）30 s，延伸60℃30 s；最后于60℃延伸7 min。
在本实验中仅对各目标微生物种群进行了相对定量分析，制作标准曲线所用的DNA参照模板为纯化后的样品DNA，针对各古菌类群，其制作过程如下：采用表2-6中引物，包括MBT-set、MMB-set、Mst-set、Msc-set和ARC-set分别对纯化后的DNA样品进行扩增，反应体系为50μL，包括：1×PCR缓冲液（5μL），0.75 U的Taq DNA聚合酶（0.6 μL），0.2 mmol/L核苷酸（1μL），0.40μmol/L引物（各0.5μL），1.5 mmol/L MgCl2（3μL）。PCR程序为：预变性94℃10 min；45个循环包括：变性94℃10 s，退火60℃（MMB-set使用63℃）30 s，延伸60℃30 s；60℃延伸7 min。各古菌类群标准曲线的建立方法与共生乙酸氧化细菌相同，参照本书第2.4.3节。
PCR反应均在Mastercycler®ep realplex2qPCR仪（Eppendorf AG，Hamburg，Germany）内进行。共生乙酸氧化细菌的测试方法同3.2.3章节。
5.数据分析与计算方法
参照2.5节。