免疫细胞的检测

检测各群体淋巴细胞的数量与功能是判断机体免疫状态的重要手段。外周血是患者的主要检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾脏、淋巴结及其他组织作为标本。

（一）外周血单个核细胞的分离及鉴定

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。其原理为：红细胞和多形核白细胞的比重（约1.092）大于PBMC（约1.075），将肝素抗凝血叠加于比重为1.077的分离液液面上，可通过低速离心将不同比重的细胞分层：红细胞沉于管底；多形核白细胞密集布于红细胞层与分离液之间；血小板悬浮于血浆中；PBMC则密集于血浆层与分离液界面。若需纯化淋巴细胞，可将分离的PBMC铺于培养皿上，吸附单核细胞，收集未贴附的细胞即为富含淋巴细胞悬液。进一步可用尼龙毛分离法、免疫磁珠分离法、流式细胞术等分离鉴定细胞。

（二）免疫细胞功能测定

1.淋巴细胞功能测定的体外试验——淋巴细胞增殖试验 PHA、Con A、抗CD3抗体能非特异性地活化T细胞，引起T细胞增殖；PWM能非特异性地活化B细胞，引起B细胞增殖。抗原能特异性地活化相应T、B细胞，引起相应T、B细胞增殖。可用以下方法检测淋巴细胞的增殖的水平。

（1）3 H-TdR掺入法：细胞在增殖过程中，DNA和RNA合成明显增加，如加入3 H-TdR，会被掺入到DNA分子中。细胞增殖水平越高，掺入的3 H越多。培养结束后收集细胞，用仪器测定样本中放射性活性，可反映细胞的增殖水平。本法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，易发生放射性污染。(https://www.daowen.com)

（2）MTT比色法：MTT为一种噻唑盐，化学名为3（-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，是一种淡黄色可溶性物质。T细胞增殖时，线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为紫褐色的甲臜颗粒，甲臜生成量与细胞增殖水平呈正相关。该颗粒被随后加入的二甲基亚砜所溶解，使细胞培养上清液呈紫褐色，用酶标仪测定光密度（OD）值，可反映活细胞增殖水平。本法灵敏度不及3 H-TdR掺入法，但操作简便，且无放射性污染。

2.淋巴细胞功能测定的体内试验——迟发型超敏反应（DTH）的检测 为体内检测细胞免疫功能的简便易行的皮试方法。其原理是外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原做皮试可发生迟发型超敏反应，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血、渗出，于24～48小时发生，72小时达到高峰。阳性反应表现为局部皮肤红肿和硬结，反应强烈的可出现水肿，甚至局部组织坏死。细胞免疫正常者一般出现阳性反应，细胞免疫低下者则呈弱阳性或阴性反应。目前常用来检测某些病原微生物感染、免疫缺陷病和肿瘤患者的细胞免疫功能测定等。皮试常用的生物性抗原有结核菌素、念珠菌素、麻风菌素等。

（三）细胞毒试验

细胞毒实验技术是检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术，主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。常用的技术有：

1.51 Cr释放法 用放射性核素Na2 51 CrO4标记靶细胞，当效应细胞杀伤靶细胞后，51 Cr可从被杀伤的靶细胞释放到培养基中，用γ计数仪测定51 Cr放射活性，应用公式可计算效应细胞的细胞毒活性。

2.乳酸脱氢酶释放法 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）存在于细胞内，正常情况下不能透过细胞膜。细胞受到损伤时细胞膜通透性增加，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH可催化底物如硝基氯化四氮唑蓝（nitrotetrazoliun blue chloride，NBT）形成有色的甲基化合物，通过读取上清液OD值，可计算出效应细胞的细胞毒活性。