十二、讨 论
本系列研究阐明了DSS复合低氧对脑部炎症的作用。首先探讨DSS复合低氧对动物存活和体重的影响。实验发现DSS复合低氧可降低动物存活率，减轻体重。其次，研究低氧对DSS诱导的肠炎的作用。结肠病理学的变化和结肠炎症细胞因子mRNA水平表达的增加表明低氧能够加重DSS诱导的肠炎。接下来，探讨低氧复合DSS对外周血中炎症的影响。实验发现外周血中炎症细胞因子IL-1β和IL-6水平升高，结果表明低氧增强DSS诱导的外周血中的炎症反应。然后探究低氧复合DSS对脑部炎症的作用。实验发现小胶质细胞的激活和炎症细胞因子mRNA表达的上调，提示低氧促进DSS诱发的脑内炎症反应。最后探讨低氧加重DSS诱导的脑内炎症可能的作用机制，观察低氧复合DSS处理后紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达的变化。实验发现低氧复合DSS明显降低紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达，促进血管内皮细胞间紧密连接结构的开放和BBB通透性的增加，进而加重脑损伤。
在本实验中，利用3% DSS处理5 d，成功诱导肠炎。DSS处理后，动物体重降低，结肠长度缩短和炎症细胞因子表达增加。该结果与文献报道的DSS诱导肠炎的表现相符。目前，主流观点认为在炎症性肠病的病程中，依据实验条件和细胞类型的不同，低氧和低氧诱导的信号通路发挥促炎和抗炎两种相反的作用。一方面，低氧激活结肠上皮细胞HIF-1α的表达，增加上皮细胞屏障保护蛋白CD73和腺苷A2B受体的表达以及具有抗微生物作用的β-defensins的表达，从而减轻肠炎。另一方面，低氧促进巨噬细胞的炎症因子的表达和粒细胞β2-integrin的表达，增加对内皮细胞的黏附和渗透。此外，低氧还可以促进上皮细胞的凋亡，进一步增加屏障的通透性。Halligan等研究发现给予脯氨酸羟化酶（PHD）抑制剂可以减轻DSS诱导的肠炎。另外，Roger J等研究发现低氧处理18 h通过炎性小体蛋白NLRP3表达降低和自噬的激活减轻小鼠肠道炎症。本实验的低氧条件（海拔6000m，2 d）与文献中的低氧处理或给予PHD抑制剂所致的低氧环境在程度和持续时间上不同，由此低氧产生的作用不同。在同一种细胞中，HIF-1α和HIF-2α的作用也不尽相同。Solanki等研究发现肠上皮细胞HIF-2α的持续激活则促进炎症介质的表达，破坏上皮屏障的完整性，诱发肠炎。PHD抑制剂对HIF-1α的激活作用较HIF-2α更明显。肠炎使肠道菌群失调，条件致病菌如大肠杆菌增加，有益菌群如双歧杆菌减少。高原低氧也能够导致动物的肠道菌群失衡，类杆菌和大肠杆菌等条件致病菌的数目增加，棒状杆菌和粪球菌的数目减少。肠道菌群的失调可导致上皮细胞和黏膜损伤，增加屏障通透性。低氧加重DSS诱导的肠炎是否与肠上皮细胞HIF-2α的激活以及固有免疫细胞内HIF-1α的激活和菌群的失调有关，需要进一步探讨。
DSS破坏肠上皮黏液层并对上皮细胞产生毒性作用。肠上皮屏障结构的破坏使肠腔内的菌群和其代谢产物进入黏膜固有层内，激活肠内的免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞并释放炎症介质，进一步活化循环系统内的免疫细胞，产生炎症细胞因子。在本研究发现DSS使外周血中炎症细胞因子TNF-α和IL-6水平增加，与文献报道一致。DSS复合低氧联合作用，能够进一步增加外周血中炎症因子水平，该结果与Song等研究LPS联合低氧暴露增加循环系统中炎症因子水平相符。
在病理状态下，外周的免疫细胞，如粒细胞、骨髓样细胞通过损伤的血脑屏障进入大脑，激活脑内的免疫细胞，并释放炎症介质，触发炎症反应。本研究发现DSS使小胶质细胞的活化增加和炎症细胞因子mRNA水平升高，诱导脑内的炎症反应，与Han等的研究相符。DSS复合低氧联合作用使脑内的炎症更加明显，与LPS复合低氧暴露作用的结果相符。外周的炎症细胞因子可以通过血脑屏障的通透性增加，进入脑内。在本实验中，低氧复合DSS作用明显下调紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达，提示血脑屏障的通透性增加，与文献相符。(https://www.daowen.com)
肠道菌群可以通过神经、免疫、内分泌等多种途径，与大脑进行双向交流和调节，这种双向作用的通道被称为微生物-肠-脑轴。大脑可以通过微生物-肠-脑轴调控肠道菌群的多样性和胃肠功能，肠道菌群也可以通过该轴调节大脑功能和有关行为改变。目前，作为菌群和大脑在免疫方面相互交流的主要方式，肠道菌群和小胶质细胞间的相互作用受到越来越多的关注。Erny等发现无菌动物脑内的小胶质在成熟、活化状态、形态等方面存在缺陷，肠道菌群的再移植可以改变小胶质细胞的这种表型，结果表明在正常条件下，肠道微生物菌群对小胶质的成熟是必需的。研究最多的肠道菌群发酵产物是短链脂肪酸，短链脂肪酸主要包括乙酸、丙酸和丁酸。它们参与胃肠道功能、昼夜节律、免疫调节等过程。短链脂肪酸主要发挥抗炎作用。Imhann等研究发现在炎症性肠病患者粪便样本中丁酸水平降低，菌群的发酵产物短链脂肪酸可以减轻无菌动物小胶质细胞的形态和不成熟的缺陷。Arnoldussen等研究发现给予丁酸盐可以改善低密度脂蛋白受体转基因动物的空间记忆的受损和小胶质细胞的激活。Nagashima等在脑脊液中检测到乙酸，没有检测到丙酸和丁酸，可能与丙酸和丁酸在循环系统中含量很低有关。前面文献中提到DSS诱导的肠炎和高原低氧都可以使肠道菌群的组成发生变化，那么肠道菌群的代谢产物短链脂肪酸是否参与DSS复合低氧对脑部炎症的作用这个问题还需要进一步研究。
星形胶质细胞在高原脑水肿的发生发展中起着重要作用。星形胶质细胞的终足是血脑屏障的组成结构，星形胶质细胞参与的炎症反应也在疾病发展中起到作用。关于低氧下星形胶质细胞炎症反应的调控机制至今仍不清楚。当机体处于低氧环境时，HIF-1的降解被抑制，HIF-1与BNIP3启动子上的低氧反应元件（hypoxic responsive element，HRE）结合，激活BNIP3的转录。BNIP3有着双重作用，既可以促进细胞凋亡或坏死，也可以介导线粒体自噬，促进细胞存活。BNIP3可以通过caspase凋亡途径，线粒体膜电位的丢失，线粒体膜通透转换孔的开放，细胞色素C的释放等方式介导细胞死亡。自噬是借助溶酶体降解细胞内组分的一个过程，线粒体自噬是指以自噬的方式清除细胞内损伤的或不需要的线粒体，维持线粒体的动态平衡。借助结构中LC3相互作用结构域（LC3-interaction region，LIR），BNIP3与自噬体外膜上的微管相关蛋白1-轻链3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）结合，组成线粒体和自噬体的复合物，再与溶酶体结合，线粒体被降解。BNIP3也可以与Bcl-2竞争性结合，释放出Beclin-1，引起线粒体自噬。目前关于低氧下星形胶质细胞中BNIP3的表达的研究报道较少。Torronteras R等研究发现在1% O2处理6 h后，人的星形胶质细胞中HIF-1α稳定表达，从而其下游靶基因BNIP3表达增加，促进细胞存活和发挥神经保护作用，但具体的作用机制不明。而何芳等实验表明在氧糖剥夺/复氧模型中，胶质细胞系C6细胞的BNIP3表达增加，介导细胞凋亡。Guo等研究发现在氧糖剥夺/复氧模型中，人神经元细胞系HCN-1A细胞的BNIP3表达增加，介导自噬，起到保护作用。黄广海等实验发现在脑缺血3 h和9 h，BNIP3表达升高，线粒体自噬被激活，随着缺血时间延长至24 h，BNIP3表达降低，线粒体自噬被抑制，脑梗死体积增大，说明在脑缺血早期，BNIP3可能通过线粒体自噬起到保护作用。上述结果提示在缺血缺氧或氧糖剥夺模型中，BNIP3表达的增加可以直接诱导细胞凋亡，也可以激活自噬，介导细胞存活或死亡作用。
在本实验中，我们发现LPS刺激能够使低氧下星形胶质细胞的BNIP3表达进一步增加，说明LPS可能参与调控低氧下BNIP3的表达。随着低氧时间的增加，BNIP3可能被泛素蛋白酶体降解。因此，在LPS+低氧组，24 h的BNIP3的表达低于12 h。此外，本实验发现低氧联合LPS刺激增强星形胶质细胞的炎症反应。该结果表明BNIP3可能参与星形胶质细胞炎症反应的调控。接下来我们研究了BNIP3的表达变化对星形胶质细胞的炎症反应的作用及其可能机制。通过敲低或过表达星形胶质细胞中的BNIP3，观察在低氧联合LPS刺激条件下星形胶质细胞的炎症反应，存活和线粒体自噬变化，发现BNIP3调节星形胶质细胞炎症反应可能的机制，为星形胶质细胞炎症反应的调控机制，提供一些思路。