垂体器官的发育
垂体由垂体前叶、后叶及退化的中叶组成，位于蝶鞍内，垂体柄穿过硬脑膜与下丘脑正中隆起相连。垂体起源于口腔神经板，人类胚胎3周左右，口腔前庭的原始外胚层凹陷形成Rathke’s囊，是腺垂体的起源，腺垂体的细胞分化主要在前12周完成。Rathke’s囊直接连接到垂体柄和下丘脑漏斗部，最终从口腔和鼻咽分离出来，突向第三脑室并与脑室憩室融合，随后空腔消失。Rathke’s囊形成腺垂体，神经垂体随着第三脑室发育从神经外胚层发育而来。
腺垂体的细胞可根据其分泌激素的种类分为不同的细胞群，促肾上腺皮质激素细胞分泌包括促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotrophic Hormone，ACTH）在内的阿片-促黑素细胞皮质素原（Proopiomelanocortin，POMC）肽类，生长激素细胞分泌生长激素（Growth Hormone，GH），促甲状腺激素细胞（Thyrotrophs）分泌糖蛋白激素α亚单位和促甲状腺激素特有的TSHβ亚单位，促性腺细胞分泌卵泡刺激素（Follicule-Stimulating Hormone，FSH）和黄体生成素（Luteinizing Hormone，LH），催乳素细胞分泌泌乳素（Prolactin，PRL）。胚胎发育过程中，这些不同的激素分泌细胞都起源于Rathke’s囊前体细胞，垂体的发育过程是前体细胞终末分化为不同细胞类型的经典发育模式 [1]。
1.垂体器官形成的信号和转录机制：脊椎动物从胚胎发育、器官发生到形成完整生命体的过程受到复杂的信号通路的精密调控，下丘脑-垂体轴被认为是连接大脑与外周激素分泌器官的神经内分泌传感器，其发育过程中也需要一系列转录因子及信号通路的参与。垂体的形态发生需要很多重要的神经外胚层信号参与，包括初始囊内陷所需要的漏斗骨形态生成蛋白4（BMP4）、成纤维细胞生长因子8（FGF8）、Wnt5和Wnt4；接下来腹侧的形态发展及转录因子的表达则由BMP2以及音猬蛋白（Shh）进行调控，它们的空间和梯度表达对决定细胞增殖的早期模式至关重要。
（1）骨形态生成蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）：BMP是调控早期垂体发育不可或缺的调节因子，BMP4和BMP2参与垂体前叶的发育。BMP4属于转化生长因子β（Transforming Growth Factor，TGFβ）超家族，与口腔外胚层分化为垂体过程中的细胞分化塑形密切相关。胚胎发育第8.5～9天，BMP4蛋白在腹侧间脑表达，继而在漏斗区表达，垂体发育后期表达水平降低。口腔外胚层和腹侧神经外胚层内陷形成Rathke’s囊的起始步骤依赖于BMP4的存在，BMP4阻断将导致垂体发育停滞以及垂体中所有激素分泌细胞的缺失。BMP2控制垂体腹侧多种转录因子的表达，也控制糖蛋白激素α亚单位基因的表达，α亚单位基因表达是TSH细胞和促性腺细胞分化早期的标志性信号。BMP2信号途径使祖细胞向特异的激素分泌细胞分化，并调节各种细胞类型在垂体腹侧的区域定位[2]。
（2）音猬蛋白（Sonic Hedgehog，Shh）：分泌因子Shh在器官整体发生过程中起到重要作用，Shh敲除导致胚胎轴向发育异常、Rathke’s囊缺失，然而这种现象可能源于间脑/漏斗中线结构的缺失而不是前叶垂体原基的缺失。小鼠垂体发育过程中，Shh在间脑腹侧和口腔外胚层表达，而在Rathke’s囊形成的区域并无表达。Shh可能在BMP2信号通路级联反应中发挥作用，决定垂体腹侧的细胞系谱。锌指转录因子Gli1、Gli2、Gli3可能是Shh信号通路的下游分子，灭活Gli1/Gli2会导致发育过程中垂体缺失。
（3）成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor，FGF）：器官形成过程中，FGF家族的不同成员在细胞类型分化的不同阶段发挥不同的生物学作用。垂体发育早期，FGF8、FGF10、FGF18在间脑腹侧和垂体后叶表达，FGF8和FGF10控制垂体细胞增殖和不同细胞类型的区域限制性分布。FGF10受体（FFGRⅡb）条件性敲除的小鼠模型，Rathke’s囊初步形成后很快发生凋亡，导致胚胎第14.5天时垂体器官发育不全；这提示FGF10信号通路调节发育过程中的细胞存活/凋亡 [3]。FGF8阻断导致发育第8.5天时胚胎死亡，先于垂体器官形成。漏斗管形成可刺激细胞增殖，促进Lbx3表达，FGF8可部分模仿漏斗管的生物活性模式，FGF8过表达可使Lbx3表达增强和垂体增生。总的来说，FGF8的主要功能是维持细胞增殖，对抗BMP2的分化信号。
（4）Notch 信号途径：目前已知的调节垂体原基分化起始过程的信号通路是Notch通路。Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，由Notch受体、Notch配体（DSL蛋白）及细胞内效应器分子（CSL-DNA结合蛋白）3部分组成，调节从海胆到人类等多种生物的胚胎发育。目前研究较为明确的Notch途径靶分子是HES家族成员，包括HES1、HES5。垂体发育过程中，Notch途径与HES1、HES5参与垂体祖细胞的维持和垂体中叶以及后叶的发育调控。Notch途径直接调节转录因子PROP1的表达，PROP1的出现是表达Pit-1的前体细胞形成的必要条件。随后，Notch信号在Pit-1前体细胞中的衰减对不同谱系的Pit-1垂体细胞的形成是必要的，促甲状腺激素分泌细胞和促性腺激素分泌细胞内过表达Notch将导致细胞发育缺陷，异常Notch激活导致的发育缺陷与bHLH转录因子Mash1、Mash3的表达降低有关 [4]。Mash1是促甲状腺素分泌细胞、促性腺激素分泌细胞、促糖皮质激素分泌细胞和促黑素分泌细胞终末分化的执行者，垂体中Mash3的表达需要Pit-1的调节，从胚胎发育第13.5天持续到成年，负责调节对GHRH的反应。
（5）Wnt/β-连环蛋白信号途径：Wnt蛋白家族是一种分泌性的信号分子，在发育过程中参与胚胎诱导、细胞命运决定、稳态维持。经典Wnt/β-连环蛋白通路的激活使β-连环蛋白稳定性增加，继而向核内转位作为DNA转录因子结合域的共活化因子发挥生物学作用；多数情况下，Lef/T通过置换HDAC、TLE/groucho 共阻遏物和募集p300/CBP、Brg1，促进靶基因表达。Wnt/β-连环蛋白还参与Pit-1决定的前体细胞谱系分化和垂体的生长，因此Wnt/β-连环蛋白信号通路从胚胎第11.5～15.5天在垂体中是处于激活状态的，可通过检测其下游直接的靶基因Axin2评估其活性。短暂的Wnt/β-连环蛋白控制对正常的垂体发育是必要的，胚胎第13.5天时，β-连环蛋白不充分激活导致的Hex 1抑制可使垂体发育不全。Wnt/β-连环蛋白信号通路的其他成员，如Fzd2、Lef1、Tcf3、Tcf4，在垂体发育过程中也有表达。胚胎第12.5天时，在Rathke’s囊和漏斗中可检测到Fzd2；胚胎第9～14.5天可在垂体中检测到Tcf3，而且只局限于有Pit-1表达的体部；Tcf4在发育早期的垂体及周围组织中可检测到，胚胎第13.5天以后显著降低；Lef1有两个表达时相，胚胎第9天时在Rathke’s囊短期表达，胚胎第13.5天时在垂体前叶和中叶再次出现。灭活Tcf4导致垂体前叶增生，灭活Lef1导致Pit-1、GH、TSHβ表达增加[5]。Wnt家族的其他成员在发育中的垂体也可检测到，其中Wnt4、Wnt5与垂体前叶的发育密切相关。
2.控制垂体发育早期阶段的转录因子：各种类型的腺垂体细胞的功能发展涉及多能垂体干细胞表达的细胞系特定转录因子动态梯度的时空调节，生长激素细胞、促甲状腺激素细胞、催乳素细胞都来源于表达转录因子Pit-1的前体细胞，Pit-1是垂体特有的转录因子，其表达依赖于与其成对出现的转录因子PROP1的存在；而促肾上腺皮质激素细胞的终末分化依赖于转录因子Tbx19（T-box Transcription Factor）。因此，全能干细胞分化为腺垂体细胞系的主要决定因子是PROP1，因为它决定了后续Pit-1依赖性细胞系的发育和促性腺激素细胞系的发育。
垂体早期细胞分化需要细胞外Rpx和Ptx的表达。如图4-1所示，Rathke’s囊表达LIM同源异型结构域激素家族的多个转录因子，包括Lhx3、Lhx4、ISL1，它们对垂体功能发育早期具有重要作用。Ptx是广泛的垂体调节因子，也能活化α糖蛋白亚单位（αGSU）、LHβ（Ptx1）及GH（Ptx2）的转录。Lhx3能决定GH、PRL和TSH细胞的分化。PROP1是Pit-1的先决条件，能够活化GH、PRL、TSH和促生长激素释放激素受体（GHRHR）的转录。TSH细胞和促性腺激素细胞表达共同的α糖蛋白亚单位（αGSU），其表达受Gata2调控。这些转录因子时间与空间的表达变化参与调控形态和功能各异的激素分泌细胞的形成。
图4-1 口腔外胚层神经上皮细胞增殖、分化形成Rathke’s囊的过程需要Lhx3、Lhx4、ISL1等多种转录因子的精密调控，对垂体祖系前体细胞形成及垂体功能早期发育具有重要作用。PROP1是垂体特有转录因子Pit-1的主要调控因子，它决定了由垂体祖系前体细胞到腺垂体各功能性细胞系的分化和发育过程。TSH细胞和促性腺激素细胞发育过程还受到DNA结合元件Gata2的调节(https://www.daowen.com)
（1）PITX：目前已有3个PITX相关的转录因子被发现，它们与Bicoid（以前又叫作P-Otx 或PITX1）共有同源结构域。PITX3 对哺乳动物中脑多巴胺能神经元的正常发育至关重要。PITX1和PITX2基因在几乎所有类型的垂体细胞中表达，并持续整个发育过程；PITX1和PITX2的表达分布区域虽有重叠但并不相同，这两个转录因子呈剂量依赖性促进细胞增殖和分化，PITX2的生物学功能相对更强大，PITX1或 PITX2都能控制Lbx3的表达。PITX1于垂体器官形成早期在神经板前区和口腔外胚层表达，可与垂体特有的转录因子Pit-1的氨基末端结构域相互作用。目的性破坏PITX1结构导致垂体促甲状腺素分泌细胞和促性腺激素分泌细胞的终末分化标志减低 [6]。PITX2基因是在人Rieger综合征的基因定位克隆过程中发现的。PITX2基因敲除小鼠有很多先天性缺陷，包括Rathke’s囊和漏斗部连接建立后的早期垂体发育停滞，垂体发育过程各种信号分子梯度的形成也出现异常。PITX相关的转录因子与αGSU、TSHβ、LHβ、FSHβ、GH、PRL、GnRHR基因启动子结合调节其转录过程。
（2）LIM同源域蛋白（The LIM-Homeodomain Proteins，LIM-HD）：LIM-HD蛋白分子在N-末端与DNA结合同源域间含有两个串联衔接的LIM结构域，LIM结构域为LIM-HD分子与其所募集的辅酶因子提供蛋白-蛋白相互作用的位点，从而完成LIM-HD生物学活性的发挥。Rathke’s囊表达LIM-HD家族的多个转录因子，包括Lhx3、Lhx4、ISL1，它们对垂体功能发育早期具有决定性作用。胚胎发育第9.5天时，Lhx3在Rathke’s囊特异表达，它与Lhx4协同作用在垂体早期器官形成过程中发挥决定性作用。Lhx3基因敲除鼠Rathke’s囊退化，外胚层细胞增殖障碍，除促肾上腺皮质激素分泌细胞外，其他垂体细胞类型全部缺失。漏斗FGF8诱导的Lhx3的表达在口腔外胚层分化为垂体的细胞选择过程中是关键的步骤，Lhx3可与PITX2协同作用激活垂体特异基因α-GSU的表达。胚胎发育第8.5天，ISL1最初在口腔外胚层表达；胚胎第9.5天在Rathke’s囊表达；胚胎第10.5天，ISL1的表达局限于Rathke’s囊的腹侧，与喙部聚集的促甲状腺激素细胞共定位。BMP4、BMP2 是ISL1基因表达的激活因素，而FGF8/FGF2抑制其表达，两种信号分子分别在垂体背、腹侧对ISL1的表达进行反相调节，由此形成空间上的浓度梯度对垂体发育意义重大。ISL1基因缺陷鼠胚胎第10天时，出现心脏、胰腺、运动神经元等多处发育缺陷，原始Rathke’s囊形成但上皮细胞发育畸形，这提示ISL1对于垂体祖细胞的增殖和分化至关重要。
（3）Hesx1：转录因子Hesx1是同源域基因配对构象家族（Paired- Like Class of Homeodomain Genes）的成员。Hesx1的表达受Lhx3和PROP1的调控，Hesx1首先在脊索前板前体细胞内表达，胚胎发育第9.5天时在间脑和Rathke’s囊表达，其在垂体的表达持续到发育第12天，Hesx1表达下调伴随PROP1转录增加，垂体细胞开始进行特异性分化。Hesx1基因敲除动物的表型不一致，5%的胚胎会发生垂体发育不全。Hesx1是抑制性转录因子，其N-末端区和同源域中各含有一个阻遏域，Hexs1同源域募集NcoR/Sin3/HDAC共阻遏复合物，N-末端eh1基序可与groucho相关的Tle共阻遏复合物相互作用，Hesx1/groucho（Tle）复合物的短暂调节在垂体器官形成过程中发挥重要作用[7]。
转录因子Rpx是Hesx1的同族体，其表达局限于口腔外胚层和Rathke’s囊。多种抑制因子调控的Rpx/Hesx1 表达衰减与腺垂体细胞终末分化标志物同时出现，提示Rpx/Hesx1基因表达下调在垂体发育过程的进展中发挥重要作用。Rpx可与Pro-1形成二聚体并抑制PROP1的活性，这提示Rpx/Hesx1可拮抗PROP1的生物学功能。
（4）成对同源域因子PROP1：PROP1 是腺垂体细胞分化的决定性因子。PROP1 C-末端含有反式激活结构域，N-末端含有抑制结构域，这提示PROP1转录因子具有双向调节作用。PROP1/β-连环蛋白复合物激活Pit-1基因转录，而抑制Hesx1基因转录，PROP1转录激活/抑制作用的发挥取决于与其相互作用的辅助因子。PROP1表达起始时点与Rathke’s囊闭锁的时点一致（E10.5d），表达峰值出现在胚胎第12.5天，随后，垂体细胞特异性分化终末期（E15.5～E16.5d）PROP1表达水平逐渐下调。Notch信号通路参与PROP1表达高峰的维持。PROP1基因缺陷鼠不表达Pit-1，垂体前叶各型激素分泌细胞群扩增障碍。PROP1基因突变导致多种垂体激素复合型缺乏。
（5）Six：发育中的垂体表达Six1、Six3、Six4、Six6基因。Six1和Six4基因共表达于很多胚胎原基结构，包括Rathke’s囊；Six1或Six4基因缺陷的小鼠垂体可正常发育。Six3促进细胞增殖、拮抗Wnt信号途径和BMP通路，促进前叶垂体细胞特异分化。Six6在垂体早期发育阶段形成背-腹侧浓度梯度，胚胎第13.5天时表达降低。Six6基因敲除小鼠垂体和视网膜发育不全，机制与前体细胞分化障碍有关[8]。
（6）PAX6：PAX6在Rathke’s囊背侧的短期表达参与垂体早期发育。在胚胎发育第9天，PAX6表达于口腔外胚层，和Shh表达区域无重合；胚胎发育第10～12天，Rathke’s囊中可检测到PAX6表达并呈现出明显的背-腹浓度梯度；第13.5天，当垂体前体细胞分化开始时PAX6表达降低，直到第17.5天细胞分化进入终末期，PAX6在垂体中的表达消失。PAX6基因缺陷小鼠，垂体腹侧表达αGSU的细胞群（主要是促甲状腺激素细胞）增殖正常，而垂体背侧生长激素细胞和催乳素细胞数量显著减少。由此得出，PAX6决定垂体促甲状腺激素细胞/促性腺激素细胞、生长激素细胞/催乳素细胞的前体细胞的背-腹侧分区。
3.控制垂体各型细胞特异分化的转录因子：
Pit-1：Pit-1是一种POU同源异型结构域激素转录因子，是垂体特异的转录因子，其N-末端含有一个POU特异结构域，C-末端含有一个POU同源域，两个POU结构域中都含有高DNA亲和力的螺旋-转角-螺旋结构。Pit-1又被称为GHF-1，起初被发现有调节GH和PRL基因转录的功能；后期研究证实，Pit-1是3种特异化的垂体细胞（生长激素分泌细胞、催乳素分泌细胞、促甲状腺激素分泌细胞）增殖和分化的必要条件，并且抑制促性腺激素分泌细胞的分化。Pit-1依赖的细胞系和非Pit-1依赖的细胞系分别发育成促甲状腺激素分泌细胞和促性腺激素分泌细胞，这两种细胞系都来源于垂体腹侧，都表达糖蛋白激素共有的α亚基和激素特异的β亚基，Pit-1决定了垂体前体细胞的可塑性。胚胎第13.5天，Pit-1基因的表达需要PROP1和Wnt/β-连环蛋白信号通路的调节。
除此之外，Pit-1与GH、PRL、TSHβ亚基、GHRHR、1型生长抑素受体、TRH受体的编码基因启动子结合，与其他转录因子形成功能性异二聚体。Pit-1还能与甲状腺激素受体（Thyroid Hormone Receptor，THR）、视黄酸受体（Retinoic Acid Receptor，RAR）等核受体相互作用。锌指转录因子Gata2与Pit-1的相互作用对TSH分泌细胞的发育和TSH特异的β亚单位编码基因的表达有重要作用。
综上所述，复杂有序的信号机制精密调控下丘脑-垂体-甲状腺轴的发育，信号分子和转录因子间的相互作用介导包括促甲状腺激素分泌细胞在内的垂体细胞增殖、分化和区域化分布。