二、材料和方法
（一）实验材料
1.实验细胞
HCT-116细胞株购自中国科学院细胞库（上海）。
2.主要试剂
主要试剂见表5-1-1。
表5-1-1 主要试剂
3.主要仪器设备
主要仪器设备见表5-1-2。
表5-1-2 主要仪器设备
续表
4.主要耗材
无RNA酶枪头（10μL、100μL，1000μL），各种无酶微量离心管（1.5 mL、5 mL），冻存管均购自Eppendorf公司；培养瓶购自NEST公司。
（二）实验方法
1.主要试剂的配制
1）顺铂的配制
顺铂购于美国Sigma公司，用灭菌水配制成1 mg/mL工作液。
2）NAC溶液配制
称取1 g N-乙酰半胱氨酸粉溶解于10 mL PBS中，配制成100 mg/mL溶液，配制好后置于4℃冰箱中备用。
2.结肠癌细胞的培养、复苏、传代、冻存及计数
1）结肠癌细胞培养
结肠癌细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于细胞培养箱中培养。对贴壁细胞的培养，大约每2天更换培养基一次，大约3天传代一次，每次均取生长状态良好并处于对数生长期的细胞进行实验。
2）关于冻存细胞的复苏
从液氮罐中迅速取出冻存管，迅速放入已预先准备好的37℃水浴中，快速振荡，使冻存液在1 min内融化，放入离心机中1000 r/min离心5 min后，弃去上清液，并加入预先配制好的培养基，反复吹打，待细胞吹匀、吹散后，将细胞悬液移入培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。以后每2天左右更换一次培养基，观察细胞生长情况，并根据细胞生长密度进行传代。
3）细胞的传代
弃去培养瓶中的培养液，用灭菌好的PBS漂洗两次后，加入1 mL胰蛋白酶，在显微镜下观察胰蛋白酶消化情况，待细胞间隙逐渐增大且细胞开始变圆后，立即弃去胰蛋白酶，加入预先配制好的RPMI-1640培养基并反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之成为均匀的细胞悬液。将细胞悬液按1∶2分装入其他培养瓶中进行传代，将细胞传代扩增3～6代，其中一部分细胞用于实验，另外一部分细胞冻存备用。(https://www.daowen.com)
4）细胞的冻存
选择处于对数生长期的细胞，弃去培养液，并用PBS清洗两次，加入1 mL胰蛋白酶，并适时终止胰蛋白酶消化，加入配制好的培养基并反复吹打使之混匀，并将细胞收集于离心管中，1000 r/min离心5 min后，弃上清液。将细胞置于细胞冻存液中稀释，按照每管1 mL的量均匀分装于冻存管中，并标记好细胞名称、代次、培养基种类及冻存日期等，然后在4℃冰箱中放置5 min、-20℃冰箱中放置30 min、-80℃超低温冰箱中放置12 h，最后置于液氮罐中。
5）细胞的计数
取0.2 mL预先混匀好的细胞，加到细胞计数板中，在显微镜下计数，数4个象限中的细胞数求和得N，按照公式计算细胞浓度：n=N×10000/4。
3.细胞增殖实验（MTT法）
HCT-116细胞在含10％FBS，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO2孵箱中孵育。用RPMI-1640培养基将处于对数生长期的细胞配制成1.8×104/mL的细胞混悬液，将混悬液按每孔100μL加入96孔培养板中，在孵箱中孵育培养24 h后取出，弃上清液，每孔加200μL RPMI-1640培养基后再培养24 h后取出，弃上清液。按照预设的药物分组，同时每个浓度设3个复孔，并设立不加药物的空白对照，继续培养20 h，弃孔内液体，每孔加入100μL MTT（浓度为0.5 mg/mL），培养4h，弃孔内液体，加入100μL DMSO。振荡15 min后用酶标仪测吸光度（A570），按公式计算：细胞增殖抑制率=（A对照组—A实验组）/A对照组×100％。
4.流式Annexin Ⅴ-FITC/PI检测
通过前期预实验，筛选出浓度为100μmol/L的顺铂溶液进行后续实验，将顺铂加入铺有HCT-116细胞的6孔板中，放入孵箱中孵育培养约6h。然后用冰冷的PBS清洗2遍，加入2μmol/L DCFDA并放入孵箱中孵育培养约30 min。用冰冷的PBS清洗2遍，收集细胞后上机检测。用预先配制好的培养液将处于对数生长期的细胞稀释至8×105/mL，接种于6孔板中并置于孵箱中孵育24 h后取出，弃培养液，加入预设浓度的顺铂孵育20 h。用预冷PBS洗涤细胞2次，并将细胞重悬于结合缓冲液（binding buffer）中。加入5μL Annexin Ⅴ-FITC混匀，室温、避光反应10 min，加入5μL PI混匀，室温、避光反应5 min。筛网过滤后，上机检测细胞凋亡率。
结果判断如下。
（1）AnnexinⅤ（+）/PI（-）：早期凋亡细胞。
（2）AnnexinⅤ（+）/PI（+）：晚期凋亡细胞、坏死细胞。
（3）AnnexinⅤ（-）/PI（-）：未凋亡细胞。
5.细胞ROS检测
1）细胞准备
将HCT-116细胞在预先配好的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO2孵箱中孵育。用预先配好的培养基将处于对数生长期的细胞以8×105/mL的浓度接种于6孔板并置于孵箱中孵育24 h后取出，弃培养液，加入预设浓度的顺铂孵育20 h。
2）实验原理
ROS检测是利用荧光探针DCFH-DA进行检测的方法。DCFH-DA本身不会发生荧光，其能自由穿过细胞膜，进入细胞质，被细胞内的酯酶水解成DCFH。DCFH本身不能穿过细胞膜，探针被装载到细胞内后，ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，所检测到的DCF的荧光可间接反映细胞内ROS的含量。
3）试剂组成及其配制方法
DCFH-DA 1瓶，按预设浓度配成工作液，于4℃保存。
工作液的配制：5 mg加入1 mL DMSO中。
4）测定方法
在预先处理好的HCT-116细胞中，加入预冷PBS洗涤细胞2次，加入探针后孵育30 min，洗净残余的未进入细胞内的探针，并将细胞重悬于缓冲液中，筛网过滤后，上机检测（使用488nm激发波长、525 nm发射波长），并置于倒置显微镜下观察荧光强弱。
（三）统计学处理
各组结果数据均以
±s表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。使用SPSS 11.7软件分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。