【实训操作方法】
一、高效液相色谱法的基本原理
以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法，由经典液相色谱（柱层析、纸层析、薄层层析）和气相色谱发展而来，采用高压液体作流动相并，采用了新型固定相和连续自动检测系统，从而大大提高了理论塔板数，具有快速、高效、高选择性等特点，特别适用于大相对分子质量的高分子化合物及离子型化合物的分离与分析。因此，人们称这种新型的液相色谱法为高速、高压或高效液相色谱法（HPLC）。
高效液相色谱法按分离原理不同可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法。色谱柱中填充的固定相可以是吸附剂、化学键和固定相、离子交换树脂、葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等。实现不同组分分离主要是依靠色谱柱与流动相。待分离的混合物随流动相进入色谱柱后，由于不同组分在固定相与流动相中的吸附力、溶解度、离子交换能力不同而导致流动速度不同，或由于不同组分分子大小不同，流经固定相的途径不同，最终不同组分流出色谱柱的时间各不相同，实现依照一定顺序流出色谱柱而实现分离。
二、高效液相色谱仪的基本结构
HPLC系统一般由输液瓶、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理系统等组成，如图所示2-23，其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。
图2-23 HPLC系统结构
（一）输液泵
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一，有的仪器还有阶梯洗脱装置、在线脱气机。输液泵性能的好坏直接影响整个仪器的性能和分析结果的可靠性，为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，操作过程中应防止任何固体微粒和气泡进入泵体，流动相需要先过滤和脱气，可采用Millipore滤膜（0.2μm或0.45μm）等滤器和脱气装置，而且输液泵的滤器应经常清洗或更换。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。
（二）进样器
进样器大都使用六通进样阀或自动进样器。一般HPLC分析常用六通进样阀，其关键部件由圆形密封垫和固定底座组成。六通阀的进样方法有部分装液法和完全装液法两种：①用部分装液法进样时，进样量应为定量环体积的50%（最多75%），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应为定量环体积的3～5倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重要性。
（三）色谱柱
色谱柱是色谱系统的关键，决定组分分离的好坏，所以对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于较难分离物质的则可采用高达2万塔板数的柱子，因此一般10～30cm的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基键合到硅胶表面，又称ODS或C18。
（四）检测器
检测器的作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。紫外检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，灵敏度高，噪声低，线性范围宽。UV检测器分为固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵列检测器。使用过程中，要注意流动池内不能有气泡，避免被污染，否则产生噪声或基线漂移及出现许多线状峰，一般灯源开启稳定20～30min后，才可进样分析。
（五）数据记录及处理系统
数据记录及处理系统也称色谱工作站，通过工作站可进行全系统的自动化控制，其用途包括三方面：①采集、处理和分析数据；②控制仪器；③色谱系统优化和专家系统。
高效液相分配色谱法有反相或正相色谱法两种分离模式。反相高效液相色谱法（RP-HPLC）应用最为广泛。据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。它是采用非极性固定相（如C18等）、极性溶剂（如甲醇等）作为流动相的一种分离模式，极性较强或亲水的样品分子和反相柱中的固定相上的互相作用较弱，分配较少，因此随着流动相较快流出。
三、高效液相色谱仪的操作流程
（一）开启仪器
打开计算机，并运行Bootp Server程序；打开1100LC各模块电源；待各模块自检完成后，双击Instrument Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入工作站界面。
（二）排气泡
流动相过滤、脱气后使用，打开废液阀（purge阀），开启泵（pump on），设定流速“XX mL/min”冲洗，直到输液管中无气泡为止，一般需要2～5min，降低流速关上purge阀。
（三）条件设定
通过泵设定流动相组成、分析时间及流速；开启检测器灯源，设定检测波长；编辑方法method并保存，从“Run Control”菜单中选择Sample info选项，设定样品名称。
（四）进样分析
预热30min左右，等仪器“Ready”，基线平稳，准备进样；先使六通阀处于装样（load）位置，用微量注射器将样品注入定量环，快速转动手柄至进样（inject）位置，此时仪器会输出一个脉冲，标记开始采集数据。
（五）数据处理
（1）试样溶液中的组分的定性 根据标准溶液的保留时间，对试样溶液中的组分进行对比定性确认。
（2）试样溶液中组分含量的计算 根据色谱峰面积（或峰高）测定样品中某一组分的准确含量。常用色谱的定量方法有内标法、外标法和面积归一法等。
（六）实验结束
按要求关好仪器（与开机顺序相反）。
四、注意事项
（1）实验中要求用超纯水，有机溶剂为色谱纯试剂，使用前都必须经微孔滤膜滤过，以除去微粒杂质，并且使用前流动相必须脱气，否则有杂质和气泡进入系统，会影响泵、检测器、柱子，甚至使无法检测。
（2）用微量注射器吸液时，要排气泡。转动六通阀阀芯时不要太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增将损坏柱头。
（3）实验结束后，要注意冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐酸缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相（水）冲洗。
五、原始记录单
高效液相色谱仪准确操作原始记录单
（每场按台架号从小到大排列后装入回收专用袋。）
学 校____，姓 名____，准考证号____
考点名称____，场次号____，台架号____
题目：高效液相色谱仪准确操作
1.能准确使用高效液相色谱仪，能正确进行原始记录
2.取XX溶液，绘制其色谱图。
操作步骤：
记录人：日期