5.2.3 多能干细胞及其下游干细胞来源的胰腺类器官
1.多能干细胞来源的胰岛类器官
人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs），包括胚胎干细胞（human embryonic stem cells，h ESCs）和诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）等，具有近似无限增殖和分化为几乎所有细胞类型的潜能［27］。近年来，多能干细胞的体外定向分化技术得到了极大的发展。通过模拟胰腺的胚胎发育过程，利用细胞因子和化学小分子组合调控胰腺发育相关信号通路，研究者已经可以在体外将多能干细胞逐步诱导分化为胰腺前体细胞、内分泌前体细胞和胰岛内分泌细胞，并开始以这些细胞为种子在体外构建具有复杂结构的胰腺类器官。
胰腺或胰岛移植可以有效克服胰岛素疗法的不足，是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病的理想治愈手段，然而受制于供体严重缺乏和异体免疫排斥等因素而难以推广。利用多能干细胞在体外制备胰岛组织/类器官有望根本解决供体胰腺/胰岛移植的瓶颈问题，在糖尿病的细胞替代疗法中具有巨大的临床价值和应用前景，因而成为类器官领域的研究焦点之一。基于Douglas Melton团队在胰腺胚胎发育领域的扎实积累，Novacell公司的研究者们首先建立了二维分化体系，将人胚胎干细胞分阶段诱导为定型内胚层、PDX1＋胰腺内胚层和PDX1＋/NKX6-1＋胰腺祖细胞，并证实该方法获得的胰腺祖细胞在糖尿病小鼠模型中可以进一步分化为具有功能的胰岛内分泌细胞［28］。之后，一系列研究进一步证实了多能干细胞来源的胰腺前体（或内分泌）细胞也可以在体内分化为成熟的内分泌细胞［29-33］。然而，这些体外定向分化体系获得的INS＋细胞，多数是既表达胰岛素也同时表达胰高血糖素和/或生长激素抑制素的“多激素前体细胞”（polyhormonal），实际上是胚胎发育中也会出现的α细胞的前体，无法响应血糖刺激分泌胰岛素，移植到体内后会进一步转变为α细胞。直到2014年，Timothy Kieffer团队和Douglas Melton团队同时报道了新的定向分化体系，可以规模制备具有真正β细胞的胰岛类器官［34，35］。这些胰岛类器官包含单激素的、可以响应葡萄糖刺激的胰岛β细胞，以及少量的胰岛α、δ和PP细胞；移植到Streptozotocin诱导的糖尿病小鼠体内后，可逆转小鼠的高血糖表型。
图5-3 多能干细胞来源胰岛的体外制备(https://www.daowen.com)
目前较为成熟的、能在体外将多能干细胞诱导分化成胰岛类器官的方法均采用多阶段分步诱导（stage-specific differentiation）的方式（图5-3）。第一阶段是利用高浓度Activin A及CHIR99021将多能干细胞诱导成为FOXA2＋/SOX17＋/EOMES＋定型内胚层（definitive endoderm cell）。CHIR99021可以激活Wnt信号通路，使多能干细胞向中内胚层细胞分化，而高浓度的Activin A会模拟体内原肠运动时期Nodal信号促进内胚层形成的作用；第二阶段和第三阶段是将定型内胚层细胞依次诱导分化为原始肠管细胞（primitive gut tube cell）和前肠后端细胞（posterior foregut cell）。其中，第三阶段的分化培养基中会添加特定浓度的Retinoid Acid（在胰腺及肝的内胚层形成中激活HOX基因，提供重要的位置信息），以及Sonic Hedgehog信号通路抑制剂SANT1（促进胰腺方向的分化）、FGF7或FGF10（促进PDX1＋内胚层细胞的增殖），此时的细胞为PDX1＋/SOX9＋胰腺前体细胞。第四阶段是将前肠后端细胞诱导分化为PDX1＋/SOX9＋/NKX6-1＋的多潜能胰腺祖细胞（multipotent pancreatic progenitor cell）。Nostro等发现在该阶段的培养基中添加EGF、Noggin和Nicotinamide可以高效地诱导NKX6-1的表达。在第四阶段结束后，将此时的贴壁细胞消化为细胞团，细胞团经在低吸附的培养皿中经过24小时培养后将形成实心的细胞球，后续分化将以悬浮的三维细胞球形式进行。第五阶段是将胰腺内胚层细胞诱导分化为胰腺内分泌前体细胞（pancreatic endocrine progenitor cell）。该阶段培养基中添加TGF-β信号通路的抑制剂ALK5 inhibitor II、BMP信号通路的抑制剂LDN193189，以及Sonic hedgehog信号通路抑制剂SANT-1和T3（提高内分泌前体细胞关键转录因子NGN3的表达）。第六阶段和第七阶段是将胰腺内分泌前体细胞依次诱导分化为不成熟的胰腺内分泌细胞（immature pancreatic endocrine cell）和成熟的胰腺内分泌细胞（mature pancreatic endocrine cell）。其中，第六阶段培养基中添加的Notch信号通路抑制剂GSI-XX可以提高β细胞的分化效率，第七阶段培养基中添加的AXL受体酪氨酸激酶抑制剂TROLOX和乙酰半胱氨酸可以诱导与β细胞功能成熟相关的关键转录因子MAFA的表达。经过7个阶段的诱导，多能干细胞可以定向分化为具有与原代细胞相似形态结构和细胞组成的胰岛类器官。
2.内胚层干细胞来源的胰岛类器官
虽然基于多能干细胞的胰岛类器官制备体系得到了长足的发展，然而这些体系仍然面临三大瓶颈问题：①种子细胞具有体内成瘤性；②过程复杂、效率低；③胰岛细胞功能不成熟，因此极大阻碍了多能干细胞来源的胰岛类器官成为糖尿病治疗药物的进程。为了克服这些难题，程新等人于2011年建立了世界首例“人类原始胚层干细胞系”——“人内胚层干细胞系”（EP cells/hEnSCs）［36，37］。相比基于多能干细胞的体系，基于hEnSCs的胰岛类器官再造体系具有：①种子细胞、中间过程的前体细胞以及终末分化的胰岛类器官在体内均不成瘤；②胰岛类器官具有与成体一致的分子特征、细胞组成及功能，可高效逆转糖尿病动物（鼠及食蟹猴）模型的高血糖症状；③涉及的细胞培养及分化过程不依赖于动物源性成分；④可制备患者特异性的再生胰岛组织等一系列优势。
3.多能干细胞来源的其他胰腺类器官
Ling Huang等在2015年报道了一种基于高浓度Matrigel的二维培养系统［38］，用于扩增培养PDX1＋/SOX9＋/NKX6-1＋多潜能胰腺祖细胞。Goncalves等使用Matrigel包埋的培养方式，实现了多能干细胞来源的胰腺前体细胞以实心球状类器官形式的持续扩增［15］，并证实EGF和FGF信号通路对于胰腺前体细胞的维持和扩增至关重要。Meike Hohwieler等尝试使用低吸附悬浮培养和Matrigel包埋培养的方式，以多能干细胞来源的胰腺前体细胞为起始细胞，成功构建了腺泡细胞和胰导管细胞共存的胰腺外分泌类器官，其中腺泡细胞表达多种消化酶，胰导管细胞则表达转录因子SOX9并且具有碳酸酐酶活性［39］。Markus Breunig等通过小分子化合物筛选，建立了将多能干细胞诱导分化为胰导管细胞的培养方法［40］，并以胰岛管细胞为种子构建了具有空心球状结构的胰导管类器官。Ling Huang等则发现，激活经典Wnt、FGF和Cortisol信号通路的同时抑制Hedgehog、Notch、BMP和TGF-β信号通路，可以使多能干细胞来源的胰腺前体细胞在Matrigel中高效地形成腺泡类器官［41］，其中的腺泡细胞呈圆柱状，表达腺泡细胞标志物PTF1A、RBPJL和CPA1，并具有少量分泌囊泡。