12.3.1 组织学特征鉴定
1.全层皮肤3D模型
三维全层皮肤模型含有真皮层和表皮层，简单地重现了与人类皮肤相似的组织学结构。组织学切片观察显示表皮层厚度约为130μm，具有完整清晰的复层化结构：角质层（stratum corneum）、颗粒层（stratum granulosum）、棘层（stratum spinosum）和基底层（sratum basale）。真皮层厚度约为100μm，有大量的胞外基质合成，类似于天然皮肤真皮乳突层的结构（图12-3）。
图12-3 三维全层皮肤的培养方式和组织结构
免疫组化染色可观察到表皮层表达兜甲蛋白（loricrin）、丝聚蛋白（filaggrin）、细胞角蛋白（keratin，KRT）10和谷氨酰胺转氨酶（transgfutaminase）1；表皮基底层有增殖细胞的相关抗原Ki67表达；表皮真皮连接层表达胶原蛋白（collagen）Ⅳ、Ⅶ、Ⅻ，层粘连蛋白（Laminin）Ⅴ，串珠素（Perlecan）等［31］。
2.复杂皮肤类器官
由人类多能干细胞为细胞来源构建的皮肤类器官模型具有与人类皮肤相似的复杂结构，包括毛囊、皮脂腺、脂肪、神经、血管和淋巴管等成分。本章节将以哈佛大学Karl Koehler团队［2，7］提出的皮肤类器官构建体系介绍皮肤类器官各个时期的组织学和基因表达特点。(https://www.daowen.com)
如上文所述，由人类多能干细胞构建的复杂皮肤类器官分3个主要阶段获得。第一阶段中，解离的多能干细胞发生迁移并紧密地结合在一起形成小球样细胞聚集体。通过TGF-β抑制剂、BMP4及FGF的处理诱导，在第3天，小球样细胞聚集体向外萌出，形成外胚层表面和未分化的多能干细胞核心，此时聚集体周围形成一个薄而明亮的透明样上皮。第二阶段，根据细胞系的不同，上皮首先发育为呈波浪形或线性结构，在第3～第5天可见；分化第6天，聚集体的囊性结构更为明显，包含深色核心和间充质细胞迁移残留的放射状痕迹；分化第9天，聚集体继续变大，间充质细胞在聚集体表面增殖增加；分化的第12天左右，聚集体成熟，中间层萌出，间充质细胞通常集中在聚集体的一极，而另一极更具囊性。此阶段颅神经嵴细胞发育完成，皮肤类器官含有颅神经嵴细胞、表皮和真皮前体。第二阶段结束时，皮肤类器官形成由角质形成细胞、间充质细胞、神经和神经胶质祖细胞组成的囊性皮肤类器官，包含自组装形成的表皮、真皮以及球状毛囊。第三阶段，经过一个月左右的培养，皮肤类器官的表皮层向皮肤类器官核心分化形成复层结构，成纤维细胞完全包裹表皮的基底层，构成皮肤类器官的外壳；分化第55～75天，毛发基板和毛胚（hair placodes and germs）初步形成；分化第75～90天进一步分化为毛钉（hair pegs）；至第110～130天，皮肤类器官形成了更精细的毛囊结构，其中包含皮脂腺、梅克尔细胞和活化T细胞核因子1（nuclear factor of activated T cells 1，NFATC1）阳性的毛囊干细胞样细胞。毛囊发育启动后，培养的后期阶段会不断有新的毛囊形成，因此，在类器官培养的第120～140天，类器官内会出现处于不同发育阶段的毛囊。完全成熟的皮肤类器官包括具有色素沉着的毛囊、皮脂腺、脂肪细胞、黑色素细胞、感觉神经元和施旺细胞等。将该皮肤类器官植入裸鼠背部皮肤上的小切口中，表皮与宿主表皮融合，毛发垂直生长，最终形成扁平、多毛且几乎完全天然的皮肤。
免疫组化染色显示了类器官在各个阶段的基因表达特点（表12-1）。分化第3天，外表皮层表达E-钙黏附蛋白（E-cadherin，ECAD），神经上皮表达N-钙黏附蛋白（Ncadherin，NCAD）；分化至12～21天，囊性上皮表达ECAD以及转录因子激活蛋白2α（activating enhancer-binding protein 2，TFAP2A）；间充质细胞表达TFAP2A、血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）、P75神经营养素受体以及SRY相关的高迁移率组盒蛋白10（SRY-box transcription factor 10，SOX10），ECAD则不表达；分化第35～45天，表皮形成复层结构，基底层（basal layer）表达KRT5、KRT17、TFAP2A、CD49f，中间层（intermediate layer）表达KRT10及TFAP2A，周皮层（periderm layer）表达KRT15及KRT17；分化第55～75天毛囊形成，毛胚表达P-钙黏附蛋白（P-cadherin，PCAD）、LIM同源框2（LIM homeobox 2 gene，LHX2）及外异蛋白A受体（ectodysplasin A receptor，EDAR），毛乳头（Dermal papilla）表达SOX2；分化第85～140天，KRT5可标记类器官上皮、毛囊外根鞘（outer root sheath）和新形成的毛胚，SOX2标记上皮中的黑色素细胞或默克尔细胞，碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子（mcrophthalmiaassociated transcription factor，MITF）标记毛囊外根鞘和上皮中的黑色素细胞。
表12-1 皮肤类器官各时期发育特点
（续表）
