15.2.2 组织微环境模拟
细胞微环境的时空动态调控对指导干细胞的分化和类器官的形态发生具有重要作用。细胞微环境因素包括生物化学和生物物理因素，主要由内源的自分泌、旁分泌信号以及外源的细胞外基质、生长因子和机械力等组成。基于对组织细胞微环境的深入认识和理解，如何在体外培养体系中优化类器官生长微环境成为领域研究的热点。随着生物材料、微流控器官芯片技术、生物打印和干细胞生物学的发展，工程化3D类器官模型的构建成为可能［16］。例如，微流控技术可通过精确控制细胞微环境因素，如机械流体、可控3D培养和细胞-细胞/基质相互作用等，指导细胞的一系列行为（如细胞黏附、分化和增殖）和类器官形态发生。将微流控技术与类器官结合，将有利于整合各自的优势，提高类器官系统的生理相关性和可重复性［17-19］。生物材料具有相对明确的成分、良好的生物相容性、可调的物理化学性质（如软硬度）等特点，可以作为3D仿生基质或支架材料，模拟细胞基质微环境，从而调控类器官发育过程［20］。生物打印技术在组织器官制造、器官移植和修复等生物医学领域具有重要意义。生物打印由带有活细胞的生物材料组成，这些活细胞可以层层叠加的方式进行精确定位，从而创建模拟天然组织和器官的结构和功能的3D生物结构［21-23］。结合以上这些工程技术和策略，将有望实现具有可控仿生组织微环境和高保真度的复杂类器官模型的构建。
1.可控动态培养
传统方法中，类器官通常是在培养皿中培养和产生，类器官的尺寸和大小不均一，且缺乏动态可控的微环境，产生的类器官具有较高的变异性。因此，需要建立生成类器官的稳定方法以提高类器官的可重复性。2017年，秦建华团队较早地将器官芯片技术引入干细胞衍生的类器官培养体系［19］。利用微柱阵列芯片可控形成具有均一大小和形态的hiPSCs来源的拟胚体，实现了脑类器官的原位发育和高通量产生，从而大大减少了传统类器官操作步骤的繁琐和类器官的变异性。最近研究报道了基于水凝胶的微孔培养系统来控制类器官的产生，类器官之间具有相似的形态大小和分化效率［24-26］。例如，利用仿生水凝胶聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）［24］或聚碳酸酯薄膜［25］制备的阵列微孔，也可以实现类器官的尺寸控制，降低其异质性。
传统类器官培养体系通常是静态培养条件，由于营养物质供应有限，组织内部往往会出现细胞坏死，从而影响类器官的长期存活。尽管有一些旋转生物反应器或摇床已经用于类器官的动态培养，然而，这些系统中的流体或剪切力通常不可控，有可能导致类器官的异常分化。微流控技术可以通过精确控制微流体来模拟血流灌注，是解决这一问题的潜在策略。例如，Sangeeta Bhatia等人利用可灌流培养的微流控芯片构建了iPSCs来源的3D肝组织模型［27］。将iPSCs分化的肝细胞与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）混合培养并包埋在PEG水凝胶微球中，进一步将微球置于芯片上进行连续灌注培养，可有效提高肝组织活性并提高白蛋白分泌。这一策略可进一步应用于其他类器官的培养和工程化模型构建等。秦建华团队构建了含有微孔阵列结构的多层芯片系统，在灌注培养条件下，发现流体培养条件可减少类器官细胞坏死，增强胰岛素分泌功能，并通过调节细胞外黏附蛋白（E-cadherin）的表达促进胰岛类器官的成熟。类似地，动态培养微环境有利于增强hiPSCs衍生的肝类器官的细胞活性和特异性功能，促进肝类器官分化和成熟。这些研究证明了动态培养微环境在促进类器官分化和功能成熟中起到重要作用。
随着类器官技术的发展及对各胚层、组织器官建模的需要，类器官的培养方法也越来越多样。包埋法和悬浮培养法是上皮组织类器官的经典培养方法，是将细胞或细胞聚集体包埋于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中形成半球状凝胶块，之后加入培养基使胶块浸没并进行悬浮培养。近年来，气液界面培养法也逐渐用于一些具有特殊结构的类器官培养。气液界面培养法通常需要利用含有多孔膜的细胞培养小室，将细胞或聚集体包埋于ECM后接种于上层小室暴露于空气，只在下层加入培养基，形成气液界面，从而产生特定类器官［28，29］。例如，肺上皮类器官的培养，将上层气道上皮干细胞接触空气，底端接触分化培养基，上皮细胞可分化成与体内气道上皮组织结构和细胞成分一致的假复层柱状上皮。肿瘤与免疫细胞的共培养也可以利用气液界面培养法［30，31］。Chiara M.Cattaneo等人研究发现结肠癌类器官、外周血单核细胞和添加抗程序性死亡受体1（programmed death receptor 1，PD-1）治疗共培养能够产生肿瘤反应性CD4+T细胞和CD8+T细胞［32］。
2.生化因子梯度控制
生物化学梯度是生物学中普遍存在的重要信号，是确保体内平衡、离子转运和远距离细胞信号传导的基础［33］。理解和操纵这些梯度能够帮助我们精确指导和调控类器官发育和生成。一般情况下，类器官在干细胞自组织发育过程中，通过在特定时间点施加诱导因素，激活特定信号通路，使类器官向特定谱系进行分化和成诱导熟［34］。传统的类器官诱导和培养过程中，添加外源因子能够影响类器官分化命运和效率。但是这种自发形成的外源因子或是干细胞自分泌的因子，往往浓度差异不均一，形成条件不可控，导致干细胞分化形成的类器官存在异质性。(https://www.daowen.com)
传统细胞培养方法难以生成规律变化的梯度并进行精确控制。微流控技术可以用来建立因子浓度梯度，通常基于流体分流和汇合装置实现梯度控制，可以用来研究细胞的趋化性、干细胞发育或药物筛选。例如，Lutolf研究组报道了一种梯度芯片，可在体外人工实现干细胞的空间分化。通过在通道中灌注PEG水凝胶将外侧流体通道和中央细胞培养通道分隔开形成屏障，可在中央细胞通道中产生浓度梯度。将人多能干细胞（human pluripotent stem cells，h PSCs）暴露于中央BMP4信号梯度中，可实现细胞分化模式的空间调控［35］。体内神经管发育过程涉及Wnt等信号因子的浓度梯度，指导神经管向特定的轴向发育。研究人员设计了一种在凝胶区域内产生正交线性因子浓度梯度的微流控芯片装置。利用该芯片装置将嵌在胶原基质中的小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）暴露于维A酸（retinoic acid，RA）和平滑激动剂（smoothing agonists，SAG）正交浓度梯度的组合中，模拟了体内神经管发育过程中，运动神经元在高浓度RA和SAG条件下的优先分化的过程［36］。近期，Pedro Rifes等利用含有网格结构的浓度梯度芯片实现了Wnt信号梯度的产生和控制，指导干细胞的分化，模拟了神经管的前—后轴发育模式［37］。
3.细胞外基质调控
类器官的培养通常依赖ECM，ECM可为干细胞体外培养提供3D条件，并模拟生理条件下的基质环境，促进干细胞在体外自组装形成具有3D结构的类器官。这一方法适用于大多数上皮组织来源的类器官及其肿瘤类器官。类器官培养体系中常用的ECM为动物源性细胞外基质（如Matrigel），然而Matrigel的蛋白质成分较复杂，具有不可控性和批次差异性，很难明确其理化因素在类器官形态发生中的作用，并可能导致产生的类器官在结构和表型等方面具有较高的变异性。最近研究显示，选用成分明确的水凝胶材料可以替代Matrigel，并通过调节其化学组成、结构和机械因素等理化性质，指导类器官的定向分化产生。例如，Nicolas Broguiere等人利用纤维蛋白类水凝胶支持上皮类器官的产生和长期培养［38］。并发现交联层粘连蛋白-111（laminin-111）的纤维蛋白水凝胶更有利于促进上皮类器官的增殖和生长。此外，合成水凝胶PEG具有无毒性和良好的渗透性，被广泛用于细胞培养和组织工程。研究人员利用PEG水凝胶促进ESCs衍生的3D神经管的形成［39］。与Matrigel相比，优化的PEG水凝胶诱导形成的神经上皮细胞更加均一化和极性化，更有利于神经管的背腹轴形成。
ECM是组织细胞发育和生长的支架和营养成分，除了明确ECM的蛋白质成分来实现类器官的可控产生，ECM的力学参数，包括材料刚度、应力松弛、降解速率和几何形状等都会影响细胞的命运，调控类器官的形态发生等生物学行为［40-42］。因此，在生成类器官时应考虑这些参数可能通过调控干细胞向特定谱系分化的关键信号通路来影响类器官的形成和发育。Matthias P.Lutolf等设计了一种成分确定、软硬度可调的功能性PEG水凝胶，其含有RGD黏附肽（arginine-glycine-aspartic acid），利于细胞的黏附。利用这种PEG水凝胶材料调控PSCs来源肠类器官的增殖和分化［43］，发现软基质材料（～190Pa）可促进肠干细胞的分化和肠类器官形成，而机械强度相对较硬（～1.3kPa）的基质材料有利于肠干细胞的增殖［40］。因此，可控的ECM微环境对类器官的形成、分化和成熟等命运调控具有重要的作用和意义。水凝胶材料已显示出巨大的潜力和优势来通过调节其生化或机械特性构建可控的细胞微环境。将微流控技术、生物材料等领域与类器官进行交叉融合，结合时空可控的机械信号，模拟组织ECM微环境来引导类器官的生长发育，有望提高类器官产生的可重复性，产生更加真实地反映体内生理特点的类器官模型系统。
4.生物物理因素控制
到目前为止，已有类器官的分化和维持体系，主要依靠细胞因子和小分子化合物的定向诱导，指导类器官的定向分化和功能成熟。然而，组织微环境中除了生化因素，生物物理因素（如机械力、拓扑结构、生物电信号等）也对类器官的形成和发育起到重要影响，然而这些生物物理因素在传统类器官培养体系难以进行模拟和研究。借助生物工程策略，有望探讨生物物理因素在干细胞命运决定和类器官形态发生过程中的作用。人体内环境中存在各种机械力，包括流体剪切应力、收缩力和组织形变等，这些生物力学因素在不同维度对组织的形成和发育产生重大影响。有研究利用可控机械力影响类器官的发生和发展，模拟人体器官的结构和功能。例如，Kang Kug Lee等构建了一种具有腔内蠕动流的人胃类器官芯片，通过控制腔内流体流动来调节胃类器官的节律性收缩和舒张，模拟胃的蠕动［44］。该模型有利于胃类器官的长期培养和实时成像。此外，通过不同的拓扑结构调控干细胞的分化和组装，在一定程度上可减少类器官产生过程中的变异性，产生具有复杂结构和功能的类器官。结合微纳加工技术，微流控芯片可根据特定组织器官的结构特点，灵活设计相应的拓扑结构进行干细胞的培养和分化。例如，研究人员根据肠特有的隐窝结构，设计了一种具有阵列凹槽结构的芯片，这种图案化微结构能够模拟肠隐窝结构，导向肠干细胞的分化和迁移，从而产生具有绒毛结构的肠组织［45，46］。这种工程策略为发现和研究在干细胞发育过程中与机械信号相关的类器官形态发生的机理提供了新的思路。