五、反转录

五、反转录

大多数生物体的遗传信息储存在DNA分子中，将DNA分子上储存的信息用于指导蛋白质的合成而体现其生物学功能，其间有RNA的参与。这里讨论的DNA合成实际上是指RNA指导的DNA合成，即以RNA为模板，利用宿主细胞中4种dNTP为原料，在引物的3′端以5′→3′方向合成与RNA互补的DNA链的过程。此过程与中心法则方向相反，故称为反转录（reverse transcription）。在反转录过程中以RNA指导的DNA聚合酶称为反转录酶（reverse transcriptase）。反转录并非转录，而是一种复制形式，必须有引物存在才能完成。

（一）反转录酶

1970年，Termin在Rous肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）、Baltimore在白血病病毒中各自发现了反转录酶，以后发现所有RNA肿瘤病毒中都含有反转录酶。反转录酶是反转录病毒RNA编码的，是多功能酶，具有以下活性：①具有RNA指导的DNA聚合酶活性，能和其他DNA聚合酶一样，沿5′→3′方向合成DNA，并需要引物提供3′-OH，引物为tRNA，存在于病毒颗粒中；②具有RNA酶H活性，能特异性水解RNA-DNA杂交体上的RNA；③具有DNA指导的DNA聚合酶活性，以反转录合成的单链DNA为模板合成互补DNA链；④5′末端位点特异性RNA切割酶活性。反转录酶没有3′→5′外切酶活性，因此它没有校对功能，合成的错误率相对较高，这可能是致瘤病毒较快出现新病毒株的一个原因。

（二）反转录病毒的基因组复制过程

反转录病毒（retroviruses）基因组核酸是RNA，在宿主细胞中须转变成DNA，才能进行基因表达和基因组复制。反转录病毒基因组有7 000～10 000个碱基，包含3个蛋白质基因（图3-20）：gag、pol、env。在5′端有帽子结构、LTR序列和U5序列；在3′端有poly A序列、LTR序列和U3序列。两端的LTR序列是完全相同的同向重复序列。在U5内侧有引物结合点（PBS）、剪接给体位点（SD）和包装信号（y）。在pol基因和env基因之间有一个剪接受体位点（SA）。

反转录病毒颗粒与宿主细胞膜上特异受体结合后进入宿主细胞，在胞液中脱去外壳，释放出病毒颗粒中的反转录酶和基因组RNA，反转录酶以病毒RNA为模板，通过3个阶段合成cDNA。

第一阶段：合成负股cDNA链的大部分。反转录酶以病毒本身携带的tRNA为引物，从3′-OH端开始，合成一段短的DNA序列（与基因组RNA5′端序列互补）。反转录酶的RNase H活性随即切除DNA-RNA杂交双链中的RNA序列，即病毒RNA 5′端的R、U5。病毒RNA模板的3′端回转到新合成的DNA处，3′端的R区与新合成的DNA片段中的R互补区结合。tRNA携带着新合成的DNA链移动到病毒模板RNA的3′端。反转录酶以病毒RNA为模板，在DNA片段的3′端逐个加上脱氧核苷酸，合成负股DNA，其末端与病毒基因组的5′端的PB-互补。因此，第一阶段合成的负股DNA并不是全长的，缺U5。(https://www.daowen.com)

第二阶段：以负股DNA为模板合成一小部分正股DNA链。负股DNA合成时，实际上又与模板RNA形成了DNA-RNA杂交双链。在降解杂交双链中的RNA时，在病毒RNA的PB＋和3′端的U3区之间有一个特异的缺口形成位点（nicking site），首先被打开成为缺口，反转录酶即以RNA的3′末端为引物，合成DNA，包括U3、R、U5和PB-。

第三阶段：分几步完成cDNA的全部复制。

（1）DNA-RNA杂交链中的RNA被完全降解，第一阶段合成的负股DNA的3′末端是与PB-互补的序列，第二阶段合成的正链DNA的3′末端就是PB-，因此负股DNA和正股DNA的3′末端可以通过氢键结合。

（2）在反转录酶的催化下，沿两条DNA链的3′端合成、延伸DNA链。形成完整的双链DNA。最终产物是含有RNA信息的双链DNA。双链DNA分子的两端序列相同，分别由U3、R、U5序列构成。病毒RNA携带的遗传信息通过反转录过程传递到DNA分子中。形成的双链DNA可以随机插入到细胞的染色体，插入到细胞染色体的病毒称为前病毒（图3-21）。从前病毒基因组可以转录出从5′R区至3′R区的RNA，既是mRNA，又是病毒基因组RNA。