五、生物传感器

五、生物传感器

传感器通常由直接响应于被测量的敏感元件、产生可用信号输出的转换元件和相应的电子线路所组成，一般可分为物理传感器、化学传感器和生物传感器三大类。生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术。因其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测，特别是其高度自动化、微型化与集成化的特点，使其在近几十年获得蓬勃而迅速的发展。应用它可以对生物体液中的分析物进行超微量的分析，成为检验医学的最佳框架。例如电解质、动脉血气、激素、药物，以及难于培养的细菌、病毒、衣原体，如结核菌、人类免疫缺陷病毒等。

1962年Clark和Lyons首次把嫁接酶法和离子敏感氧电极技术结合，创制了测定葡萄糖含量的酶电极，开创了生物传感器的先河。5年后Updike和Hicks制成了固定化酶电极，这是生物传感器的首次应用。20世纪70年代相继出现了电流型和电位型微生物电极、组织电极、线粒体电极。20世纪80年代，利用生物反应中的光效应、热效应、场效应和质量变化而开发的生物传感器蓬勃发展，开始了生物电子学传感器的新时代。

到目前为止，生物传感器大致经历了3个发展阶段：第一代生物传感器是由固定了生物成分的非活性基质膜（透析膜或反应膜）和电化学电极所组成；第二代生物传感器是将生物成分直接吸附或共价结合到转换器的表面，而无需非活性的基质膜，测定时不必向样品中加入其他试剂；第三代生物传感器是把生物成分直接固定在电子元件上，它们可以直接感知和放大界面物质的变化，从而把生物识别和信号的转换处理结合在一起。

生物传感器的传感原理如图1-9所示，其构成包括两部分：生物敏感膜和换能器。被分析物扩散进入固定化生物敏感层，经分子识别，发生生物学反应，产生一次信息继而被相应的物理换能器、化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经过二次仪表（检测放大器）放大输出，从而测得待测物的浓度。Turner将生物传感器定义为：一种精致的分析器件，它结合一种生物的或生物衍生的敏感元件与理化换能器，能够产生间断或连续的数字电信号，信号的强度与被分析物成比例。

生物传感器的分类方法多种多样，一般按照以下几方面进行分类：①按照生物传感器上分子识别元件的敏感元件不同进行分类；②按照生物传感器的信号换能器不同分类；③根据传感器输出信号的产生方式分类（可分为催化型生物传感器和亲和型生物传感器）。按①、②分类的生物传感器分类见图1-10。以下就酶传感器、免疫传感器做一简单介绍。

（一）酶电极生物传感器

依据酶与电极之间的电子传递机制大致将酶电极生物传感器分为三代：第一代生物传感器采用天然介体氧的催化机制设计制作；第二代生物传感器是将诸如二茂铁、铁氰化钾等物质作为媒介体掺入酶层中，以减小溶解氧的干扰；第三代生物传感器是指在无介体存在的情况下，利用生物活性酶与电极间的直接电子传递制作的生物传感器。

1．第一代经典电化学生物传感器　第一代生物传感器采用共价交联法可以有效地减少或消除敏感材料从载体上脱落，提高传感器的稳定性；天然介体氧直接参与酶促反应，通过电子在反应中心与电极表面之间的传递，实现生化反应信号向电信号的转换（图1-11），由于直接的电子传递过程较慢，传感器对底物敏感性不够理想，而且传感器容易受到环境氧浓度的影响。此外，在电极反应的过程中，需要较高的极化电位，在0．6～0．8V，在如此高的电位下进行氧化测定，试样中共存的其他电活性物质，如维生素C和尿酸等，也可以在此电位下氧化而产生氧化电流，给测定带来干扰，因此该方法的灵敏度和选择性相对较差。

2．第二代介体酶电极生物传感器　第二代生物传感器采用化学介体或特定生物分子取代O2／H2O2在酶促反应中和电极之间进行电子传递。作为良好的介体，需要具备以下条件：①极易参与有生物活性材料和电极存在的氧化还原反应，在均相和非均相体系中都能迅速进行电子传递；②还原态不被氧气氧化；③氧化态的再生所需要的电压低，并且不受pH影响；④对生物无毒性，不被生物催化剂作为底物；⑤易于生物催化剂共固定化；⑥在工作或保存期间有足够长的稳定时间。

经过掺杂介体物质的第二代生物传感器，具有以下的优点：①只需较低的极化电位，就能使介体氧化，因而减少了其他具有较低氧化还原电势物质干扰电极过程的机会；②二茂铁离子不与氧起反应，使传感器对氧不敏感，能够在缺氧或者氧浓度易变化的条件下使用；③二茂铁离子与还原的葡萄糖氧化酶之间的电子传递快，因而电极响应迅速；④二茂铁衍生物为水不溶性，可直接限制在电极表面，无需投放到样品溶液中。

1984年，分析化学杂志首次报道了Anthony Cass博士关于介体酶电极的研究论文，成为迄今生物传感器最成功商品的支撑技术。Cass博士将葡萄糖氧化酶（GOD）固定在石墨电极上，以水不溶性二茂铁单羧酸为介体，在电极对葡萄糖的响应过程中，二茂铁离子作为GOD的氧化剂，并在酶反应与电极反应过程之间迅速传递电子。其响应原理为：GOD（FAD）催化氧化葡萄糖后，本身被还原成GOD（FADHZ），生成的GOD（FADHZ）立即被二茂高铁氧化成GOD（FAD），而被还原成的二茂铁在电极上被氧化成二茂高铁。二茂铁在电极上氧化产生的氧化电流与葡萄糖的浓度有关。

3．第三代直接电化学生物传感器　直接电化学生物传感器主要用于解决酶等生物识别元件与电极之间的低效率通讯的问题。造成这种现象的原因包括：大多数蛋白质的电活性中心包埋在蛋白质分子深处，距离电极较远；蛋白质吸附在电极表面后，分子部分变性；不合适的空间取向等。

与前两代生物传感器相比，直接电化学生物传感器既不需要氧分子，也不需要化学介体分子作为电子传递体，通常还不需要固定化载体，而是将酶分子直接吸附固定到电极表面，使酶的氧化还原活性中心与电极直接“交流”，能够更快地进行电子传递，从而使酶电极生物传感器的响应速度更快、灵敏度更高，真正成为“无试剂分析”。

基于直接电子传递的生物传感器已经研制成功，但是，所报道的生物传感器都不太理想，存在许多问题，主要是这种原理仅限于少数氧化还原酶和氧化还原蛋白，对大部分生物催化剂还不适用。采用适当的修饰膜技术可以使蛋白质结构略微变化而不影响原有的活性，有利于扩大该方法的应用范围。此外，纳米修饰技术、生物模拟分子印迹技术等都有希望成为直接电化学生物传感测定的主流技术。(https://www.daowen.com)

（二）免疫传感器

1990年Henry等提出了免疫传感器的概念。免疫传感器技术具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便及成本低等优点。

免疫传感器已广泛地用于医学临床诊断、环境监测和食品工业等领域，获得了良好的可检测性。在半抗原测试中，对地高辛和雌二醇的灵敏度（最低检测下限）即达到了纳摩尔级（10-9 mol）。应用光学传感技术中的荧光毛细管充填装置（FCFD）检测全血中的前列腺特异抗原更可获得高敏感性（9．3×10-12　mol／L），而检测血清中乙肝表面抗原检测下限甚至达到了2×10-13 mol／L。免疫传感器已被用于多种物质的测定，如除草剂、苯酚、人尿中的刺激性药物、IgG、IgM、Ⅷ因子相关抗原、血清载脂蛋白、HCG、牛血蛋白（如牛血红蛋白、牛血清清蛋白）、人细胞（如红细胞、粒细胞和T淋巴细胞）、病毒（如人类疱疹病毒和肝炎病毒）、血清HIV特异性抗体和血管内皮生长因子（VEGF）、C1型葡萄球菌肠毒素、C2型葡萄球菌肠毒素、胰岛素、人体纤维蛋白、甲胎蛋白和日本血吸虫抗体等。

将高灵敏度的传感技术与特异性免疫反应结合起来，用以监测抗原-抗体反应的生物传感器称作免疫传感器。免疫传感器的工作原理和传统的免疫测试法相似，都属于固相免疫测试法，即把抗原或抗体固定在固相支持物表面来检测样品中的抗体或抗原。不同的是，传统免疫测试法的输出结果只能定性或半定量地判断，且一般不能对整个免疫反应过程的动态变化进行实时监测。而免疫传感器具有能将输出结果数字化的精密换能器，不但能达到定量检测的效果，而且由于传感与换能同步进行，能实时监测到传感器表面的抗原-抗体反应，有利于对免疫反应进行动力学分析。因此，它可促使免疫诊断方法向定量化、操作自动化方向发展。

由于免疫传感器的检测结果最终还需换能器转换成输出信号，其检测效果因此也往往取决于所用换能器的精确度和稳定性，故换能器的种类对传感系统来说就显得尤为重要。正是基于换能器在传感器中的特殊地位，免疫传感器的种类一般都根据换能器的不同来划分。到目前为止，可将其分为以下几种。

1．电化学免疫传感器

（1）电位测量式：这种免疫测试法的原理是先通过聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与之特异性结合，抗体膜中的离子迁移率随之发生变化，从而使电极上的膜电位也相应发生改变。膜电位的变化值与待测物浓度之间存在对数关系，因此根据电位变化值进行换算，即可求出待测物浓度。不过，虽然电位测量式免疫传感器能进行定量测定，但由于未解决非特异性吸附和背景干扰等问题，所以并未得到多少实际应用。

（2）电流测量式：电流测量式免疫传感器代表了生物传感中高度发达的领域，它们测量的是恒定电压下通过电化学室的电流，待测物通过氧化还原反应在传感电极上产生的电流与电极表面的待测物浓度成正比。此类系统有高度的敏感性，以及与浓度线性相关性等优点（比电位测量式系统中的对数相关性更易换算），很适于免疫化学传感。

1979年Aizawa第一次报道了检测免疫化学反应的电流测量式传感器，用于检测人绒毛膜促性腺激素（HCG）。在该系统中，HCG单克隆抗体被固定在氧电极膜上，过氧化氢酶标记的HCG和样品中的HCG竞争并与之结合，前者与固定抗体结合后可催化氧化还原反应，产生电活性物质，从而引起电流值的变化。此后，电流测量式免疫传感器一般都靠标记，且标记物都是酶类，包括乳糖酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶等。近些年，一些新的具有电化学活性的化合物（如对氨基酚及其衍生物、聚苯胺）和金属离子也在电流测量式免疫传感器中被用作该类免疫传感器的标记物。

（3）导电率测量式：导电率测量法可大量用于化学系统中，因为许多化学反应都产生或消耗多种离子体，从而改变溶液的总导电率。通常是将一种酶固定在某种贵重金属电极上（如金、银、铜、镍、铬），在电场作用下测量待测物溶液中导电率的变化。例如，当尿被尿激酶催化生成离子产物时，后者引起溶液导电率增加，其增加值与尿浓度成正比。1992年Sandberg描述了一种以聚合物为基础的导电率测量式免疫传感器，它与常规的酶联免疫吸附试验（ELISA）原理基本相同，只是后者的结果是通过颜色来显示，而它则是将结果转换成电信号（即导电率）。

2．热量检测免疫传感器　该类传感器的原理是：将抗原或抗体固定在包埋了热敏换能器（热敏电阻）的柱上，样品中的抗体或抗原与之发生反应后引起酶促反应，可产生20～100kJ／mol的热量，然后通过热敏电阻等元件检测出来。1991年，Urban用小型薄膜热敏电阻固定抗体来检测抗原，制成了微型热量检测免疫传感器，预示着有可能生产出大小适宜且简单的装置。

3．光学免疫传感器　对一个生物系统的反应物或产物吸收或发出的电磁射线进行测定，采用的换能器称为光学换能器。光学换能器可用来响应紫外线或可视射线，也可响应生物或化学发光产物，还能适用于含光纤的装置。早期光学系统是以分光光度测定法、固定在柱上的酶和待测产物的吸光度为基础的。后来，酶被固定在尼龙圈上，统与流动注射或气泡分析仪相连。

光学免疫传感器可分为间接式（有标记）和直接式（无标记）两种。前者一般是用酶或荧光作标记物来提供检测信号，因为受检测的光水平较低，需要复杂的检测仪器。后者占了目前使用的光学免疫传感器中绝大部分，包括衰减式全内反射、椭圆率测量法、表面等离子体共振（SPR）、单模双电波导、光纤波导、干扰仪和光栅耦合器等多种形式。其原理在于内反射光谱学，由两种不同折射率（RI）的介质组成：低RI介质表面固定了抗原或抗体，也是加样品的地方；高RI介质通常为玻璃棱镜，在前者下方。当入射光束穿过高RI介质射向两介质界面时，便会折射进入低RI介质。但一旦入射光角度超过一定角度（临界角度）时，光线在两介质界面处便会全部向内反射回来，同时在低RI介质表面产生一高频电磁场，称消失波或损失波。该波沿垂直于两介质界面的方向行进一段很短的距离，其场强以指数形式衰减。样品中的抗体或抗原若能与低RI介质表面的固定抗原或抗体结合，则会与消失波相互作用，使反射光的强度或极化光相位发生变化，变化值与样品中抗体或抗原的浓度成正比。