六、生物芯片

六、生物芯片

生物芯片（biochip）是目前国际生物技术领域的前沿技术和热点，它借鉴了计算机平行分析的思想，通过微电子、微加工技术在载体（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等）表面上有序地点阵排列一系列已知的识别分子，在一定条件下，使之与被测物质（样品）结合或反应，以一定的方法进行显示，来实现对DNA、RNA、蛋白质等进行处理和分析。最初的生物芯片是指基因芯片（Gene Chip或DNA Chip），随着分子生物技术的发展和应用领域的拓宽，生物芯片还发展了蛋白质芯片（Protein Chip）、细胞芯片（Cell Chip）和芯片实验室（Lab-On-a-Chip，LOC）等新的类型。

生物芯片具有高信息量、微型化、自动化、污染少、用途广等特点，是一种高通量筛选的研究手段，将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程连续化、集成化、微型化，可以在同一时刻对成千上万个基因的表达及蛋白质含量的变化情况进行分析。由于其巨大的分析能力，简单、快速、高效的使用方式，在疾病诊疗、新药开发、分子生物学、军事、农业、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域有一定的应用价值，同时也为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段。随着科学技术的发展，将来芯片式的POCT仪将会逐步应用到各个领域。

（一）芯片实验室

芯片实验室（Lab-On-a-Chip，LOC）也称为微全分析系统（micro total analysis system，μ-TAS），是生物芯片发展的最终目标。从本质上讲，芯片实验室就是一种微型化的生化分析仪，是将生物和化学等领域所涉及的传统的样品制备、生化反应、分离检测等基本操作步骤集成在一块数平方厘米的微芯片上，并对其产物进行分析的一种技术。它是通过微细加工和微电子技术，以及物理技术、传感器技术、计算机技术等，在固体芯片表面构建微型生物化学分析单元和系统，以实现对蛋白质、核酸、无机离子以及其他生化组分的准确、快速的检测。芯片实验室可以完成对样本的预处理、分离、稀释、混合、化学反应、检测及产品的提取，从而使现有烦琐的、不精确的生物分析过程自动化、连续化和微缩化，因此，在生物医学领域它可以使珍贵的生物样品和试剂消耗降低到微升甚至纳升级，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降。因此，芯片实验室技术已被认为是21世纪最为重要的分析前沿技术之一。

μ-TAS是由瑞士Ciba-Geigy公司的Manz与Widmer在1990年提出，他们最初的想法是发展一种可能作为一个化学分析所需的全部部件和操作集成在一起的微型器件，强调“微”与“全”。所以把μ-TAS看作是化学分析仪器的微型化。1993年Harison和Manz等人在平板微芯片上实现了毛细管电泳与流动注射分析，借电渗流实现了混合荧光染料样品注入和成功电泳分离。1994年，美国橡树岭国家实验室Ramsey在Manz工作的基础上发表了一系列论文，改进了芯片毛细管电泳的进样方法，提高了其性能与实用性，引起了更广泛的关注。1995年美国加州大学的Mathies等在微流控芯片上实现了DNA等速测序，微流控芯片的商业开发价值开始显现，而此时微阵列型的生物芯片已进入实质性的商品开发阶段。同年9月，首家微流控芯片企业Caliper Techndogles公司在美国成立。1996年Mathies又将基因分析中有重要意义的聚合酶链反应（PCR）扩增与毛细管电泳集成在一起，展示了微全分析系统在生物医学研究方面的巨大潜力。与此同时，有关企业中的微流控芯片研究开发工作也加紧进行。1998年之后，一些微流控芯片开发企业纷纷与世界著名分析仪生产厂家合作，目前全世界已至少有30多个重要的实验室（包括Mr，Stanfo大学、加州大学史柏莱分校、美国橡树岭国家实验室等）在从事这一领域的开发和研究。据报道现正在生产微全分析设备的较大公司有120多家。

LOC分析系统中，样品和试剂的充分接触、反应或分离必须有外力的作用，这种外力一般为电场力、微泵产生的正负压力或液压重力原理产生的力。人们常采用高压电源产生电场力或泵产生正、负压力作为驱动源。由芯片内产生的信号需要被检测，目前最常用的检测手段是激光诱导荧光，此外还有电化学、质谱、紫外、化学发光和传感器等。激光诱导荧光检测器主要由激发光源、光学透镜组和以光电倍增管或CCD为主的荧光信号接收器件组成。特点是检测灵敏度高，被广泛采用；但现阶段其体积仍然偏大。驱动源和检测装置是芯片实验室仪器的主要组成部分，其体积的大小直接决定了芯片分析仪的大小，因此人们正努力追求将这两部分做到最小。电化学检测由于其体积较小，与高压电源一起可制成便携式分析仪，在尺寸上和芯片实验室的概念匹配，加之有电化学响应的物质很多，所以在芯片中的应用研究较多。电化学检测器的一般做法是将电极集成到芯片上，采用安培或电导法进行检测，其中电泳分离电压对检测电流的干扰是电化学检测需要克服的问题之一。用于电化学检测的电极材料有碳糊、碳纤维、铜丝、金丝等。被检测物质有氨基酸、肽、碳水化合物、神经递质等。把电泳分离、酶联免疫和生物化学集成于一体的芯片实验室研究已有报道。研究者们正努力将现有的检测方法移植到芯片实验室的检测上，如质谱法、紫外-可见检测法等。现行的质谱仪一般都体积庞大，与芯片实验室的发展不匹配，不过，近来Polla等研制出了质谱芯片，他们把离子化腔、加速电极、漂移腔、检测阵列等器件集成在只有1枚硬币大小的硅片上。

LOC的特点有以下几个方面。①集成性：目前一个重要的趋势是集成的单元部件越来越多，且集成的规模也越来越大。所涉及的部件包括和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀（包括主动阀和被动阀），微泵（包括机械泵和非机械泵）；微混合器，微反应器，当然还有微通道和微检测器等。最具代表性的工作是美国Quake研究小组将3　574个微阀、100个微反应器和1　024个微通道集成在尺寸仅有3．3mm× 6mm面积的硅质材料上，完成了液体在内部的定向流动与分配。②分析速度极快：Mathies研究小组在一个半径仅为8cm长的圆盘上集成了384个通道的电泳芯片。他们在325s内检测了384份与血色病连锁的H63D突变株（在人HFE基因上）样品，每个样品分析时间不到15s。③高通量：前述的Quake和Mathies两个研究小组的研究成果已显示出这一特点。④能耗低，物耗少，污染小：每个分析样品所消耗的试剂仅几微升至几十微升，被分析的物质的体积只需纳升级或皮升级。这样不仅能耗低，原材料和试剂及样品（生物样品和非生物样品）极少（仅通常用量的百分之一甚至万分之一或更少），从而使需要处理的化学废物极少，大大降低了污染。⑤廉价、安全：无论是化学反应芯片还是分析芯片，由于上述特点随着技术上的成熟，其价格将会越来越廉价。针对化学反应芯片而言，由于化学反应在微小的空间中进行，反应体积小，分子数量少，反应产热少，又因反应空间体表面积大，传质和传热的过程很快，所以比常规化学反应更安全。而分析芯片因污染小，而且可采用可降解生物材料，所以更环保和安全。

（二）基因芯片

传统的核酸检测包括样品前处理、核酸扩增（通常是PCR技术）及扩增产物的检测等步骤。核酸检测的微全分析系统就是要将这些步骤集中在一个微小芯片内，这也是芯片实验室的主要研究内容。然而，就目前而言，基于核酸检测的微全分析芯片遇到了很大的难度。这主要是因为传统的核酸检测技术，如整合了核酸扩增及检测的实时荧光PCR技术的ABI的PCR仪，在高通量、重复性、成本、检测灵敏度和稳定性上都有很大的优势。因此，基于微流体的核酸检测技术很难找到自己的优势，其发展方向只能是在整合性，即集成多项功能在一个微芯片上，并且价格便宜，操作也要简单，即向POCT的方向发展。然而，和其他检测方法不同的是，如果仅仅将原有的检测方式小型化或微型化，对于核酸检测而言，需要多种试剂，反应各步骤过程也不一样，因此需要阀门的设计，增加了设计难度；而且对于传统的光学检测方式，分析仪器也限制了其进一步的发展。对于微全分析芯片POCT检测而言，必须考虑可靠性及成本。

除了常规的荧光检测及电泳检测外，目前也有很多研究者研究适合POCT的检测方式。Hou等人使用场效应管对扩增出来的PCR产物进行检测，PCR产物无需标记；Ahmed等将芯片扩增后的DNA样品不用提纯，直接滴加到可抛弃的印刷电化学芯片上，DNA与作为电化学探针的氧化还原性分子结合，引起探针分子的电流值明显降低，由此可以间接检测出所结合DNA的量。这种方法快速、简便、成本低。使用这种方法成功进行了单核苷酸多态性（single nucleotide polymor-phisms，SNPs）的检测，而SNP被认为是非常好的基因标志，通过检测个体的SNPs可以预测疾病、准确诊断疾病及预测个体对治疗药物的反应，有助于制定更加有效安全的个性化治疗策略。这两种方法都是直接出来电信号，易于和后续的IC信号处理电路集成，是POCT中核酸检测有前景的发展方向。

POCT中核酸检测另一个发展趋势是将微流体芯片技术与传统的免疫层析试纸条技术相结合。Wang等人制作的微全芯片，使用水凝胶作为阀门，在检测方式上，引入新型材料——上转换发光材料（up-converting phosphor，UCP）及地高辛作为检测的标记物。UCP以其独特的上转换发光现象，将微观进行的免疫反应以可被仪器精确检测的可见光信号表现出来。而这种可见光与集成化的光学电子元件相结合后，便可被物理换能器接收，进而转换为电压值或电流值，并与目标被检物的具体浓度一一对应，从而实现定量检测。与传统的荧光检测不同的是，UPT是以能量较低的红外光作为激发光，因而完全避免了来自检测样品腐蚀以及自身衰变导致的发光淬灭。Chen等人使用相同的技术（图1-12），将样品前处理、PCR及免疫层析试纸条技术检测相结合，这一技术已成功用于检测口液中的致病菌。这种方法，芯片成本低，结果易于判读，可半定量或定量检测。

（三）蛋白质芯片

POCT最早引起人们关注的就是基于膜条的免疫层析方法，然而，免疫层析技术由于膜条重复性及胶体金的固定问题，在定量方面存在一定问题。基于微流体技术的免疫检测则可以在一定程度上解决这个问题。

如Amic公司推出的新型免疫层析芯片（4Cast Chip），使用注模成型（injection molding）制作模仿膜条结构的芯片，由于微加工注模成型技术的重复性远远高于免疫试纸条的加工，因此液体迁移的重复性和稳定性都得到了极大的提高。利用微流体技术进行酶联免疫吸附实验（ELISA）反应近年来也引起人们极大的关注。如Bhattacharyya等人使用化学发光的方法在采用热压方法（hot embossing）制备的微流体芯片内检测C反应蛋白（C-reactive protein），整个过程在25min以内，配合手持式的小型化学发光设备，可以完成POCT的要求。

除了免疫层析和ELISA方法外，目前，将免疫反应与电泳芯片相结合也引起人们的关注。Herr等人在芯片内集成过滤、富集、混合，配合芯片电泳，从口液中检测如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）及白介素6（inter-leukin-6，IL-6）等多种疾病标记物，时间在250s内，样品仅需10μL，而检测灵敏度可以达到nm～pm级。(https://www.daowen.com)

表面等离子体谐振（SPR），由于可以无标记进行检测，而且近几年来便携的SPR仪也得到了很大的发展，配合可抛弃的芯片，可以快速、低成本地进行POCT检测，因此也引起人们关注。

纳米材料在芯片实验室的蛋白检测中也发挥着重要的作用。Hahn等人提出一种新型的利用磁泳进行免疫检测的方法，并用于特异性过敏原（IgE）的检测。通过免疫反应组成荧光标记微球-IgE-超顺磁纳米磁珠的复合体，复合体在芯片内梯度磁场下偏移主流道轨迹的速度与结合的超顺磁纳米磁珠数量相对应，进而可以得到IgE的量。

Goluch等人提出一种称为生物条形码检测技术（bio-barcode assay，BCA）的方法，采用可抛弃的芯片，将金纳米颗粒与磁珠结合，利用磁珠的磁性分离目标蛋白，通过胶体金的银染进行信号放大。这种方法可以检测极低浓度的蛋白。

量子点材料由于量子产率高、光稳定性好、激发波长范围宽等优点，同一单色激发光可同时激发多色荧光，不需要复杂的光路就可以同时对多个指标进行检测，从而将成为POCT未来发展的一个重要方向。目前，已有研究者对量子点在微流体上的应用进行研究。

（四）细胞芯片

细胞作为生命的基本单位，对其分析可以直接反映疾病的进行情况，如口腔癌、获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）等。其分析方法主要是细胞分型及计数，即流式细胞仪的技术。传统的流式细胞仪虽然价格越来越便宜，功能也越来越多，但就目前而言，价格仍然偏高，需专业人员在中心实验室操作，因此现有的细胞分析技术很难进入POCT市场。

在POCT细胞检测方面，芯片实验室技术相比传统的流式细胞仪等技术，具有很大的优势。微流体技术仅需微量的样本，可以进行多参数的分析，因此是POCT重要的发展方向。尤其是聚合物加工技术的发展，预计不久，价格便宜的细胞分析芯片将会出现在POCT市场上。

使用芯片实验室技术对细胞进行分析，主要是对样本中的细胞进行分离和分型计数。利用MEMS技术对细胞进行分离的技术较多，如介电电泳分离（dielectrophoresis）、磁分离（magnetic separation）、水作用力分离（hydrodynamic separation）、过滤结构分离等。

美国马塞诸塞总医院和哈佛大学医学院的Cheng等人直接在芯片内通过生物素-亲和素的作用固定抗CD4的抗体，患者的指尖血液样本注入芯片中，CD4＋的T淋巴细胞被捕获，而血液中其余的细胞流走。通过对捕获的细胞进行显微镜计数来判断患者艾滋病的进行情况。McDevitt等人则通过检测口腔细胞的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFC）的表达情况来对口腔鳞癌进行早期检测，也可对口腔癌症的进行情况进行判断。其制作的芯片是将微滤膜（孔径0．4μm）和PMMA流体芯片整合，通过滤膜对口腔细胞进行捕获，再通过抗EGFC的抗体和荧光标记的二抗对表达有EGFC的细胞进行染色，通过对荧光进行分析判断EGFC细胞表达的水平。这种方法将价格低廉的微滤膜集成在芯片内，成本大大降低，符合POCT的发展方向。

（五）芯片实验室技术的应用举例

雅培（Abbott）公司收购的i-STAT公司的血气检测芯片，采用微加工技术制作薄膜电极，硅微加工技术制作生物电极阵列，通过微流体毛细作用进样，配备有手持式的操作仪器，只需将2～3滴全血样品加入到芯片内，在2min内就可以通过电化学反应对全血中的电解质进行检测（Na＋，K＋，Cl-，Ca2＋），还可对pH、尿酸、葡萄糖、血气（PCO2，PO2）进行检测，这是目前微流体技术在POCT市场上最成功的产品。

i-STAT系统是一种最先进的诊断技术（图1-13），固体芯片含有生物传感器，配有化学传感膜和含化学试剂成分的膜片。采用多种传感器构件使其能够进行多种重症监护化验测试：电解质、常规化学、血气和血液学指标检测。根据测试的特殊性，产生的电信号通过i-STAT便携式临床分析仪的电流、电位或电导测试电路进行检测。

钠、钾、氯、离子钙、pH和PCO2采用离子选择性电极电位测试法进行测试。按照Nernst计算式，利用测试电位值计算浓度值。尿素首先采用脲酶进行催化反应水解为铵离子。采用离子选择性电极电位测试法测试铵离子，按照Nernst计算式，利用测试电位值计算浓度值。葡萄糖采用电流测试法进行测试。在葡萄糖氧化酶催化下，葡萄糖氧化，产生过氧化氢。释放出来的过氧化氢在电极处氧化，产生电流，后者与葡萄糖浓度呈比例。PO2采用电流测试法进行测试。氧传感器与传统的Clark电极相似。氧气通过气体渗透膜从血样中渗入一种内置电解质溶液，在阴极处还原。氧还原电流与氧溶解浓度呈比例。血细胞比容采用电导测试法测定。对电解质浓度校正后，电导率测试值与血细胞比容相关。多种计算结果适用于、TCO2、BE、SpO2、阴离子间隙和血红蛋白的测试。