实验材料与方法
1.1 实验动物与分组
雄性Wistar大鼠，体重300～360g，购自北京维通过利华实验动物技术有限公司，国家标准啮齿类动物饲料，分笼饲养，自由饮食，室温17～23℃，相对湿度60%～75%，保持12h光照。
正式实验前3天，所有动物进行5～10min跑台运动，以熟悉跑台，速度为5～10m/min，坡度为0°。大鼠跑台为杭州段氏制作BCPT-98型。
对大鼠进行6周适应性训练，每周训练5天，适应性离心训练方案参考Smolka等 (2000)[4]。实验分组: 训练适应3周组，训练适应6周组，训练适应6周后定量离心运动组。每组6只。对照组包括: 安静对照组 (同研究一的安静对照组)，3周安静对照组，6周安静对照组，安静6周后定量离心运动对照组。每组6只。适应性离心训练方案见表12。
表12 适应性离心训练方案
其中6周后定量离心负荷方案同研究一，并于离心运动后即刻，处置大鼠，取样。
1.2 测试样本的采集与处理
大鼠处置，样本采集、匀浆方式同研究一。
1.3 测试指标与方法
1．3．1 用免疫印迹Western Blotting方法[5]测试HSP70与αB-crystallin的含量
采用SDS-PAGE电泳分析方法分离肌肉匀浆中的蛋白组分:同研究一。
免疫印迹Westen Blotting实验: 同研究一。
发光显迹液配制参考奥斯伯等[6](1988)，略有改进。其中包括: 8mg鲁米诺 (购自Sigma) 溶于4ml DMSO (二甲基亚砜); 8mgp-碘苯酚 (购自Sigma) 溶于4ml DMSO，再溶于12mlp H8．2的100mmol/LTris·Cl中。用前加3%H2O260μl。
NC膜在Tris·Cl缓冲液中平衡膜后移入显迹液中，浸泡2min; 取出膜，滴干水分，将膜正面向下放在一张透明保鲜膜上，将膜紧密包起来。在暗房中，将膜正面向下放X线胶片上，曝光2～15min，常规显影、定影。
免疫印迹及结果分析: 使用YLN-2000凝胶影像分析系统进行定量分析。
1．3．2 组织匀浆总蛋白测试
同研究一。
1．3．3 血清CK、LDH的测试方法
同研究一。
1．3．4 肌肉匀浆测SOD、MDA方法
同研究一。(https://www.daowen.com)
1．3．5 肌肉石蜡切片测定Desmin表达
石蜡切片机为美国Opitcal (北京304医院烧伤研究所提供)。Desmin一抗为ZM-0091Mouseanti-Desmin，免疫组化试剂盒为二步法免疫组化检测试剂盒PV-6001/6002，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
免疫组化法检测Desmin的表达试验步骤: 将每个石蜡块切成5μm厚的骨骼肌横断面切片10～20张，捞到载玻片上干燥过夜 (37℃)。然后，进行免疫组化染色分析。
(1) 石蜡切片，常规脱蜡至水 (下行: 二甲苯2次→100%乙醇2次→95%乙醇1次→90%乙醇1次→80%乙醇1次→70%乙醇1次→蒸馏水)。
(2) 3%H2O2去离子水孵育5～10min，阻断内源性过氧化物酶。
(3) 滴加小鼠来源的Desmin一抗，37℃孵育1～2h或4℃冰箱过夜，PBS洗2min×3次。
(4) 滴加山羊抗小鼠Ig G抗体-HRP多聚体，室温或37℃孵育20～30min，PBS冲洗2min×3次。
(5) 用DAB显色液显色。
(6) 蒸馏水或自来水终止反应，充分冲洗，可进行苏木素复染 (衬托细胞核)。
(7) 梯度酒精、二甲苯脱水透明(上行: 二甲苯2次←100%乙醇2次←95%乙醇1次←90%乙醇1次←80%乙醇1次←70%乙醇1次←蒸馏水)，中性树胶封片; 干燥过夜(37℃)。
组织切片的图像分析: 组织切片染色后，显微镜观察，通过Panasonic WV-CP410/G摄像头和BOSERBS602A图像采集卡进行图像采集，之后用Scion Image (national institutes of health， USA) 分析Desmin在组织的表达情况。用Scion Image测量肌细胞中Desmin染色的光密度，以此反映其含量。每组取3个样本，每样本测量5个随机视野。
1．3．6 数据统计方法
对观察分析结果用统计学分析软件SPSS10．0进行ANOVA单因素方差分析。
[1]①Lavoie，JN，H． Lambert，E． Hickey，et al． Modulation of cellular thermoresistance and actin filament stability accompanies phosphorylation-induced changes in the oligomeric structure of heat shock protein 27． Mol． Cell． Biol，1995，15: 505 ～ 516．
[2]②Vicart P，Caron A，Guicheney P，Li Z，Prévost M-C，Faure A，Chateau D， Chapon F，Tomé F，Dupret J-M，Paulin D ＆ Fardeau M ． A missense mutation in the Bcrystallin chaperone gene causes a desmin-related myopathy． Nat Genet，1998，20: 92 ～ 95．
[3]③Wang X，Klevitsky R，Huang W，Glasford J，Li F ＆ Robbins J． B-Crystallin modulates protein aggregation of abnormal desmin． Circ Res，2003． 93: 998 ～ 1005
[4]Smolka，MB．，Claudio C． Z，Armindo A． A，et al． HSP72 as a complementary protection against oxidative stress induced by exercise in the soleus muscle of rats． Am J Physiol Regulatory Integral Physiol，2000，279: R1539～1545．
[5]F． 奥斯伯等著． 颜子颖，王海林译． 精编分子生物学实验指南． 北京: 科学出版社，2001．
[6]F． 奥斯伯等著，颜子颖、王海林译． 精编分子生物学实验指南． 北京: 科学出版社，2001．