海岸带植物活性多糖
多糖是构成生物体的一类十分重要的有机化合物，是生命的物质基础。多糖的种类各异，在生物体中行使着不同的功能。因此，关于多糖的研究越来越受到研究人员的关注。海藻是海岸带植物中数量和品种最多的一类，属于低等隐花植物，主要有蓝藻、绿藻、红藻和褐藻的大型种类，另外还包括硅藻、甲藻、金藻等多门类微藻。海藻体内的生理活性物质研究已成为医药领域的热点之一。其中，海藻多糖是目前最具有前景的一类生理活性物质。近年来的研究表明，海藻多糖是由多个相同的或不同的单糖基或单糖衍生物通过糖苷键连接而成的大分子物质，具有多种生物活性及药用功能，例如增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗突变、抗辐射、抗病毒和诱导细胞分化等。
一、螺旋藻多糖
（一）概述
螺旋藻是一类古老而低等的丝状体蓝藻。蓝藻早在32亿～35亿年前就已出现在地球上，是现存地球上最早出现的光合生物。由于它们与细菌一样细胞内没有真正的细胞核，所以又称为蓝细菌。因其在显微镜下观察形态为螺旋状而得名螺旋藻。螺旋藻是蓝藻门（Cyanophyta）蓝藻纲（Cyanophyceae）段殖藻目（Hormogonales）颤藻科（Oscillatoniaceae）螺旋藻属（Spirulina）或节旋藻属（Arthrospira）的统称，主要分布于热带、亚热带的淡水或盐碱性湖泊中，目前，国内外大量养殖的主要品种有两种：极大螺旋藻（Spirulina maxima）（图2-1）和钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）（图2-2）。藻体呈丝状螺旋形，一般呈圆柱状，蓝绿色、黄绿色或紫红色，人们能很容易将螺旋藻与其他微藻区分开来。其最适生存pH为7.2～9.0，最适盐度为20～70g/L，适宜的培养温度为25～40℃。
图2-1 极大螺旋藻的外部形态
图2-2 钝顶螺旋藻的外部形态
1967年，法国的克雷曼博士在第七届国际石油会议上发表了食品藻类新类型的报告，首次全面介绍了螺旋藻的营养价值、培养方法、采收和干燥技术。同年，世界上第一家螺旋藻养殖工厂在墨西哥的Texcoco湖畔开始投资建设，并于1973年建成，正式投入生产。由于其开发不占用农田、能合理利用土地资源，且螺旋藻含有极为丰富的营养成分和生理活性物质，因此逐渐受到国内外有关方面的高度重视，成为许多国家努力开发利用的经济微藻之一，被WHO和FAO称为21世纪人类最佳保健品和理想的食品。非洲Chad湖的钝顶螺旋藻和墨西哥Texcoco湖的极大螺旋藻，它们的原产地均在北纬十几度，属于热带地区，其生长的最适温度为28～35℃，均属高温型藻种。
螺旋藻多糖是从螺旋藻中提取得到的一种酸性杂多糖，易溶于水，呈白色粉末状，是由葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖、半乳糖及葡萄糖醛酸等成分组成的。穆文静等（2011）研究显示，螺旋藻多糖具有多种生物学活性，能减轻辐射所引起的遗传损伤，抑制癌细胞的增殖，提高机体的免疫功能等。特别值得一提的是，螺旋藻多糖是天然物质，由于它对细胞无毒，明显不同于普通的细胞毒类抗癌及抗病毒药物，在新药开发中具有非常重要的意义，这也是合成类药物所不具备的优点。因此，螺旋藻多糖的研究与开发已成为目前海岸带生物医药的重要研究领域之一（于红，2003）。
（二）提取、分离及纯化
目前国内外提取螺旋藻多糖主要采用稀碱、稀酸、热水抽提的方法，因为多数糖类物质中均含有较多的极性基团，螺旋藻多糖也不例外。螺旋藻多糖是大分子物质，这种结构特征使其易溶于稀酸、稀碱和水，但是在酸性条件下进行提取，酸性环境会使得多糖中糖苷键发生断裂。所以在提取时大多数采用不同温度的水和稀碱溶液进行提取，在所参考的文献当中也发现近些年的研究中开始综合利用其他的仪器方法来进行前处理，超声分散可以使得螺旋藻干粉在浸取过程中多糖更好地溶解，而在提取温度方面也可以利用微波加热的方法，溶液温度更加均匀，还能缩短在热水提取过程中的时间。
在进行螺旋藻多糖粗提后溶解的溶液中一般都混杂有色素、核酸、蛋白质等杂质。由于螺旋藻中蛋白质的含量较高而且要得到多糖必须选择不使多糖沉淀而使得蛋白质沉淀的试剂中进行，如5%三氯醋酸-正丁醇溶液、1%醋酸等，但由于多糖在溶液中容易降解，所以对采用的分离方法要求温度低，并且处理时间短。从螺旋藻中通过浸提法得到的螺旋藻多糖粗品要进行进一步的纯化，层析法纯化是实验室采用的主要纯化方法。主要有离子交换层析法和凝胶层析法，如DEAE-Sephardex、DEAE-纤维素A-25和Sephadex-100层析柱等。
杜玲（2010）采用传统的水提醇沉法、三氯乙酸除蛋白法和活性炭脱色法提取并初步纯化了钝顶螺旋藻两个生态株的多糖，利用SephadexG-100凝胶柱层析法进一步分离纯化，得到了鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻多糖ESP和非洲Chad湖钝顶螺旋藻多糖FSP（图2-3）。
图2-3 钝顶螺旋藻多糖的提取工艺流程图（杜玲，2010）
（三）组成和结构
1.组成
螺旋藻多糖成分复杂，对多糖的组成一般采用薄层层析、纸层析、气相层析、液相层析等方法进行研究。庞启深等采用薄层层析法进行研究，结果表明钝顶螺旋藻多糖由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和葡萄糖醛酸组成。邓时锋等（2000）采用硅胶薄层层析和气相色谱法研究，结果极大螺旋藻多糖由D-葡萄糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖和葡萄糖醛酸组成。章银良等（1999）采用纸层析法研究发现钝顶螺旋藻多糖由D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和葡萄糖醛酸组成。孙向军等（2000）采用纸层析法研究了螺旋藻多糖的两个组分：一组分由D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和葡萄糖醛酸组成，另一组分由D-葡萄糖、D-甘露糖、L-鼠李糖和葡萄糖醛酸组成。张文雄等（2000）采用纸层析法研究了钝顶螺旋藻酸性杂多糖的两个组分：一组分由D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和葡萄糖醛酸组成，另一组分由D-甘露糖和葡萄糖醛酸组成。Tseng等（1994）纸层析和柱层析分析结果表明，钝顶螺旋藻多糖由L-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、葡萄糖醛酸和一种未知糖组成。王辉等（1999）采用高效液相色谱分析了钝顶螺旋藻多糖的三个组分的单糖组成：结果组分一由L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖组成，组分二由L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖组成，组分三由L-鼠李糖和D-葡萄糖组成。由以上研究报道可见，螺旋藻多糖组成研究的结果各异，这可能与藻种、分离纯化方法不同以及检测方法的灵敏度和使用范围不同有关。
2.结构
通常采用化学方法结合IR，MS，NMR，GC-MS等手段研究螺旋藻多糖的结构，但相关的研究报道较有限。王辉等（1999）报道，大多数多糖分子之间以α-糖苷键相连，也有报道介绍多糖以β-糖苷键相连。邓时锋（2000）报道，极大螺旋藻多糖经Smith降解后气相色谱分析，L-鼠李糖的含量为53%，其主链由L-鼠李糖以1→3位键合的糖苷键组成。王仲孚等（2001）从钝顶螺旋藻干粉中分离纯化得到了SPPA-1、SPPB-1和SPPC-1部位，其中SPPA-1的糖链化学结构是以→4）-a-D-Glcp-（1→残基形成主链，平均每11个葡萄糖残基中含有一个分支（图2-4）。SPPB-1含有3种糖残基和8种连接方式，该多糖的结构初步推测为→（1，2）Rha→（1，2，4）Glc及→（1，2，6）Man相对含量较大，可能是形成多糖的主链部分，→（1，2，6）Man及→（1，2，4）Glc为主链的分支点，→1）Rha是支链的末端。SPPC-1的糖链化学结构是以→（1，2）Rha→（1，3）Rha1和→（1，4）Rha糖残基形成主链，→（1，3，4）Rha残基为其分支点，→1）Glc为支链末端，平均每5个鼠李糖残基中有一个分支（图2-5）。
图2-4 SPPA-1的糖链化学结构
图2-5 SPPC-1的糖链化学结构
曾和平等（1995）报道，钝顶螺旋藻多糖主链是由葡萄糖以（1-3）、（1-6）-α-糖苷键连接而成的。杜玲（2010）以鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻和非洲Chad湖钝顶螺旋藻为材料分别制备得到了多糖部位ESP和FSP，通过TLC，HPLC，IR，NMR等技术方法分别对ESP和FSP的结构进行了研究。ESP和FSP的分子量分别为77625和85114。ESP糖链的连接方式主要为[α-Glc（1→4）-]n，还有少量的α-Glc（1→6）-、α-Fuc（1→2）-和β-Xyl（1→3）-，-α-Rha为末端糖基；构成其糖链的单糖主要是α-吡喃型的己糖，占比例最大的是葡萄糖，其次为鼠李糖和少量的阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和果糖。FSP糖链的连接方式为α-Glc（1→6）-和α-Xyl（1→2），-β-Xyl、-β-Gal 和-α-Rha为末端糖基；构成其糖链的主要是α-或β-型的吡喃葡萄糖，其次是鼠李糖和少量的木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
（四）生理活性
大量研究显示，螺旋藻多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗衰老、增强机体免疫力、提高动物的生产性能等多种药用生物活性。
1.螺旋藻多糖的抗辐射、抗突变作用
研究发现螺旋藻多糖具有抗辐射和化学诱变的作用，郭宝红等（1992）报道螺旋藻多糖处理可保护蚕豆根尖受60Co-γ的辐射损伤，减少畸变数。同时还发现，经螺旋藻多糖处理后的防护效应比处理前更为有效。使用螺旋藻多糖对受辐射的小鼠进行灌胃，能够提高存活率并有效增加小鼠体内造血干细胞的数量，对小鼠骨髓有核细胞和CFU-GM集落数都有显著的增加效果，增加CFU-Mix、BFU-E和CFU-MK的集落数。除此之外，对灌胃螺旋藻多糖的受体小鼠进行观察之后发现其造血干细胞数量有一定程度的增加。这些都显示出螺旋藻多糖具有能够加快造血干细胞和各种造血祖细胞的增殖与分化的功能，从而提高小鼠对于辐射的承受能力，加快促进造血系统因受辐射损伤后的恢复功能。可以看出螺旋藻多糖不仅具有对于辐射损害的预防功能，并且还可以作为一种功效很好的活性物质用来治疗因辐射而造成的造血系统产生的损伤。研究人员进一步用核酸内切酶实验和放射自显影技术实验考察了螺旋藻多糖对辐射损伤的保护机制，发现螺旋藻多糖能显著增强辐射引起的切除修复活性与程序外DNA合成，而且能延缓以上两个重要修复反应的饱和度。
2.螺旋藻多糖的降血糖作用
螺旋藻多糖对四氧嘧啶（ALX）性糖尿病动物都有显著的降血糖功效。用螺旋藻多糖灌胃连续注射14d，可以明显地降低由于ALX所产生的糖尿病大鼠的高血糖，同等剂量的螺旋藻多糖还能对ALX性糖尿病大鼠Tc有明显的降低作用。螺旋藻多糖还能够显著地拮抗由于葡萄糖导致的小鼠血糖的增高，实验表明了螺旋藻多糖可能会在小鼠肠道抑制葡萄糖的吸收。肾上腺素能增加肝糖原的分化分解，因而可以引起血糖的升高，螺旋藻多糖能起到对抗肾上腺素血糖升高的功效，可能与其增强外周组织对葡萄糖的摄取和利用并且抑制肝糖原的分解有关（左绍远等，2001）。
3.促进细胞生长的功能
螺旋藻多糖具有体外促进人肝胎细胞（HuH-6KK）的快速生长的作用。实验发现野生型的HuH细胞在含20%的小牛血清的即RPMI中生长不良，而在仅含0.01%的盐泽螺旋藻多糖及含20%的小牛血清的RPMI中生长良好。这对大规模细胞培养生产目的物有重要意义（Shinohara等，1990）。
4.增强机体的免疫功能
刘力生等（1991）采用灌胃或腹腔注射的方式，螺旋藻多糖均能使小鼠胸腺皮质厚度明显增加，同时可以消除或减轻环磷酞胺（Cyelophosphamide，CTX）的抑制作用。螺旋藻多糖对单核巨噬细胞系统具有一定的促进作用，使机体的自我保护能力得到增强。向小鼠腹腔中注射一定剂量的螺旋藻多糖，能使小鼠脾脏的重量明显增加，同时还能显著拮抗CTX所引起的小鼠胸腺及脾脏萎缩，而对正常小鼠胸腺的重量没有显著的影响。此外，螺旋藻多糖还具有促进骨髓造血功能，明显提高白细胞水平、抑制癌细胞增殖的能力。于红等（2003）报道，钝顶螺旋藻多糖在50～200μg/g的剂量范围对小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用，具有明显的升高荷瘤小鼠外周血白细胞的功能，能明显增加荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，能促进荷瘤小鼠NK细胞对靶细胞的细胞毒作用。左绍远等（1995）考察了螺旋藻多糖SPP对体外小鼠淋巴细胞转化的影响，剂量范围2.5～3200μg/g，结果表明，SPP可促进CoAn诱导的体外小鼠淋巴细胞转化。俞发等（2009）采用竞争性蛋白结合法观察螺旋藻多糖对小鼠脾细胞中第二信使环腺苷酸（cAMP）的影响，结果发现螺旋藻多糖可依赖性升高了小鼠脾细胞中cAMP的浓度，说明螺旋藻多糖免疫调节作用的重要机制之一是对脾细胞中第二信使cAMP浓度产生影响。
5.抗氧化、抗衰老作用
螺旋藻多糖在抗衰老的反应机理主要集中在自由基学说上。在此前对于自由基的研究中发现，人体衰老与自由基有密不可分的关系，SOD在人体内起到清除自由基的作用（周志刚等，2001）。对小鼠灌服一定剂量的螺旋藻多糖能使其肝、脑脂质过氧化物的含量降低，使血浆中SOD活性得到提高。钝顶螺旋藻多糖对D-半乳糖所致衰老小鼠有明显的改善作用，即明显促进红细胞、肝及脑SOD活性，使全血及肝GSH含量与GSH-Px活性恢复正常水平，还能使小鼠心、肝脑组织MDA含量显著降低，同时使皮肤羟脯氨酸的含量显著回升，并能显著降低肝、脑单胺氧化酶MAO-B活性（左绍远等，2001）。另外，相同剂量的螺旋藻多糖还可以起到降低小鼠游泳运动后的血乳酸水平并能有效地延长运动时间，提高衰老小鼠血清中LDH活性（左绍远等，1995）。以上的实验结果都表明螺旋藻多糖具有明显的抗氧化、抗衰老的作用。在对D-半乳糖的抗衰老模型的证明，螺旋藻多糖能提高小鼠脑、红细胞、肝SOD的活力，小鼠的各项衰老指标也得到了明显的改善，表现出较好抗衰老、抗氧化作用。
6.抗病毒作用
Toshimitsu等（1996）从钝顶螺旋藻多糖中分离得到一种硫酸化多糖Ca-SP，具有抗病毒和肝素协同因子依赖的抗凝血酶活性作用，可以诱导产生血纤维蛋白溶酶原激活剂（t-SP）。螺旋藻多糖可用于干扰病毒被宿主细胞吸附的现象，并且可以达到有效地抑制病毒的复制的效果，但是却不影响病毒的转移释放；螺旋藻多糖在抑制HSV-1糖蛋白RNA的表述上也有着显著的作用。于红（2003）实验显示，螺旋藻多糖的抗病毒靶位在于抑制HSV型糖蛋白基因的转录、抑制了感染细胞中病毒的复制再生以及阻断了病毒吸附。螺旋藻多糖具有受剂量影响的显著的反应关系。由于病毒经常在进行羟基化反应的宿主细胞中产生外壳糖蛋白的组分，宿主糖蛋白的糖部分与这种糖成分几乎完全相同，并且会让病毒在宿主细胞中显现因而避免免疫系统的控制监视。因此螺旋藻多糖抗病毒效果主要体现在干扰病毒的糖基化这个方面。
7.抗肿瘤作用
螺旋藻多糖对体外肿瘤细胞具有一定的抑制作用（张以芳等，2000）。该多糖在大剂量时对S180肉瘤、腹水型肝癌细胞DNA合成和白血病L7712细胞都有明显的抑制效用。通过研究螺旋藻多糖对S180肉瘤和AH体外癌细胞DNA、RNA、蛋白质合成抑制动力学发现，螺旋藻多糖对这3种生命大分子的抑制均随作用时间的延长而增加，其中对DNA的抑制比RNA和蛋白质高。当螺旋藻多糖从培养液中去除后，两种癌细胞DNA的合成速率都逐步恢复。由此看来，螺旋藻多糖抑制机制主要属于代谢性抑制。螺旋藻多糖对某些体内癌细胞也有一定的抑制作用，螺旋藻多糖对荷腹水型肝癌细胞有显著的抑制作用，这种抗肿瘤效果主要是通过增强机体的免疫能力来实现的。腹腔注射螺旋藻多糖，与对照组相比，虽然多糖组没有显著影响移植性腹水肝癌小鼠存活率，但使K细胞毒指数升高54.7%，而对移植性腹水肝癌小鼠存活率的影响并不显著（刘力生等，1997）。
于红等（2003）报道，钝顶螺旋藻多糖在50～200μg/g的剂量范围对小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用，具有明显的升高荷瘤小鼠外周血白细胞的功能，能明显增加荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，能促进荷瘤小鼠NK细胞对靶细胞的细胞毒作用。
二、杜氏藻多糖
（一）概述
杜氏藻（Dunaliella）是绿藻门绿藻纲团藻目多毛藻科中的一个属。杜氏藻属有29个种，其中工业化培养的有盐生杜氏藻（D.salina）（图2-6）和巴尔杜氏藻（D.bardawil）（图2-7）2个种。杜氏藻（D.salina）主要生长在内陆盐田、盐湖和近海水域，对盐度（2～35）、温度（-35～50℃）、pH（1～9）及日照等生长条件具有较宽的适应范围，具有生命力强、繁殖速度快、适于养殖等特点。在一定的生长条件下盐生杜氏藻可大量合成β-胡萝卜素，其含量可达干重的10%，目前盐生杜氏藻已成为国际市场上天然β-胡萝卜素的主要生产原料。其中从盐生杜氏藻中提取的多糖（Polysaccharide from Dunaliella salina，PDS）具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、免疫调节等多种生物活性。因此，近年来有关盐藻多糖的研究与开发日益受到关注，并取得一些进展。
图2-6 盐生杜氏藻（D.salina）的外部形态
图2-7 巴尔杜氏藻（D.bardawil）的外部形态
（二）提取、分离、化学组成和结构分析
赵永芳等（1993）以提取β-胡萝卜素后的盐生杜氏藻藻渣为原料，用0.2% Na2CO3溶液抽提，得到盐藻多糖粗品（得率约7%）；多糖粗品用Sepharose-4B层析纯化，NaCl溶液洗脱得到1个主级分和2个次级分；多糖粗品用DEAE-SephadexA-25层析柱分离时，NaCl溶液梯度洗脱得到两个级分，由于洗脱得到的各级分含糖量和蛋白质量是平行同步的，而且琼脂糖电泳后的谱带既可用糖的染色剂（阿尔山蓝），也可用蛋白染色剂（考马斯亮蓝）染色，因此，认为所得的各多糖级分均为蛋白聚糖。对于上述粗多糖，研究人员采用咔唑法测出糖醛酸的含量为20%；水解后用玫瑰红酸二钾盐反应测得硫酸基的含量不到10%；用凯氏定氮法测出蛋白质的含量超过15%。
郑尚珍等（1995）也是以提取出β-胡萝卜素后的杜氏藻渣为原料，用0.2%Na2CO3溶液提取得到粗多糖，Sevag法除蛋白后，用DEAE-纤维素和SephadexG-100柱层析纯化得到一个多糖级分，纸色谱和薄层色谱分析显示其主要成分为葡萄糖，另外还含有少量甘露糖、半乳糖、木糖和鼠李糖；甲基化分析和GC/MS检测结果显示，该多糖级分的主链为1，4-糖苷键连接的葡聚糖，3位上有分支，在支链上存在少量的其他单糖；红外光谱分析显示其糖苷键的构型主要为α-型。
丁新等（1995）以杜氏藻粉为原料，采用98℃稀碱液提取得到粗多糖D，将粗多糖用DEAE-SephadexG-25柱层析进行分离，以NaCl溶液梯度洗脱得到两个级分A和B，再将A、B分别采用SephadexG-25柱层析分离，用酸性缓冲液洗脱，分别得到D1，D2，D3和D4共4个级分；分别经苯酚-硫酸法、Lowry法、BaCl2-明胶法及咔唑-硫酸法测得这4个多糖级分的总糖、蛋白质、硫酸基及糖醛酸的含量；同时毛细管气相色谱法测定各级分的组成，结果显示各级分均含有不同比例的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、山梨糖、鼠李糖及半乳酸醛酸和葡萄糖醛酸。根据所测定的结果，推测4个杜氏藻多糖级分均为糖蛋白。
薛巧如等（2003）以提取β-胡萝卜素及醇溶性脂质后盐生杜氏藻渣为原料，采用热碱水浸提后，DEAE-52层析得到一个含糖醛酸的硫酸化杂多糖与一个硫酸化葡聚糖，气相色谱法分析上述杂多糖的单糖组成，结果为Rha∶Man∶Glu∶ Gal= 12.2∶9.5∶41.6∶31.7（摩尔比）。谢强胜等（2005）采用与薛巧如类似的制备方法获得1个硫酸化多糖，同时用TLC、GC、HPLC、IR及高碘酸氧化、Smith降解等方法对该多糖级分结构进行分析，结果显示该多糖主要成分为葡萄糖，糖苷键主要有1，4-，1，3-和1，2-三种。
戴军（2007）用提取出β-胡萝卜素等弱极性小分子物质后的杜氏藻渣为原料，在碱性条件下热水浸提，再以等电点法去除蛋白，然后醇沉、离心并干燥得到粗多糖。杜氏盐藻多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度81℃，提取液pH8.80，提取时间210min；液料比为16∶1（v/w）时，杜氏盐藻多糖的得率达到8.77%。将杜氏盐藻粗多糖经DEAE Sepharose Fast Flow柱层析分离得到PD1，PD2，PD3及PD4等4个级分，PD4又通过Sepharose CL6B柱层析分离得到PD4a和PD4b两个级分。分析结果显示，PD1是硫酸化葡聚糖（硫酸基含量为6.93%），分子量为154.8万；PD2和PD3分子量分别为3.3万和6.7万，两者均属于葡聚糖，PD3且含有少量肽链。PD4a分子量为42.4万，是含有硫酸基（含量为8.36%）、糖醛酸及少量肽链的杂多糖；PD4b含有少量糖醛酸、肽链及核酸的多糖复合物，其中以共价结合的核酸含量为49.26%，分子量为42.4万。PD4a和PD4b均是由Rha，Man，Rib，GlcUA，GalUA，Gal，Glc，Xgl等10种单糖组成的，5个多糖级分的糖残基异头碳均为α构型。核磁共振分析和甲基化分析结果表明，PD1主链结构是由D-葡萄糖通过α（1→4）糖苷键构成的葡聚糖，在支链上有约5%的葡萄糖残基，在部分葡萄糖6位上有硫酸基取代。PD4a主链结构主要是由半乳糖通过α（1→4）糖苷键，在主链Gal的2或3位有多种类型的分支，分别由Gal，Rha，Xyl，Ara构成非还原末端。其中一种含量较高的分支是由Ara取代于1，4-连接的主链半乳糖的3-O上，硫酸基主要取代于主链的Gal的C2位。支链中含有2-Gal、3-Gal、3，6-Gal、4-Glc、2-Rha等多种连接方式的糖基。
（三）生理活性
1.抗肿瘤作用
丁新等（1995）以杜氏藻为原料，采用稀碱法提取，获得粗多糖，该粗多糖在200～2000μg/ml时可明显抑制S180瘤株细胞的增殖，抑制率为60%以上，且无急性毒性。体外试验表明，该粗多糖对小鼠脾脏淋巴细胞转化率有显著提高作用。
2.抗病毒作用
Fabregas等（1999）用杜氏藻（D.tertiolecta）等10种微藻的水提物进行体外抗病毒试验，结果表明，该水提物对败血症病毒（VHSV）的复制有显著抑制作用，能一定程度地抑制非洲猪热病毒（ASFV）的复制。根据高分子硫酸化葡聚糖试样（50万）及富含硫酸化多糖的其他微藻水提取物均有同样活性，Fabregas等认为杜氏藻D.tertiolecta中起抑制病毒作用的成分可能主要为硫酸化多糖，且分子量大致数十万（因为实验表明10万和5000的硫酸化葡聚糖均没有活性）。戴军（2007）采用体外抗病毒活性的试验证实，杜氏藻中硫酸化多糖PD4a具有显著的抗流感病毒活性。PD4a的相对分子量为42.4万，与Fabregas关于杜氏藻（D.tertiolecta）中抗病毒的活性成分可能是相对分子量为50万左右的硫酸化多糖的推测相吻合。药物抑制流感病毒实验利用细胞毒性的实验结果，将PD4b和PD4a在无细胞毒浓度范围内稀释成5个药物浓度，采用CPE法测定它们的体外抗流感病毒活性。实验结果表明，PD4b无抗病毒活性，而含硫酸酯的多糖PD4a具有抗病毒活性，0.0063mg/ml即能很好地抑制甲型流感病毒引起的细胞病变（图2-8）。
图2-8 杜氏藻（D.tertiolecta）藻多糖抑制流感病毒的显微镜照片
3.抑菌和抗炎作用
尹鸿萍（2006）对谢强胜等（2005）提取的盐生杜氏藻多糖进行了小鼠体内抑菌和抗炎作用研究，结果显示该多糖具有一定的体内抑菌和抗炎活性。
4.免疫调节作用
赵永芳等（1993）首次以盐藻为原料，采用稀碱法提取，获得粗多糖，对其进行小白鼠的抗体吞噬指数和生成试验测定，结果表明，该粗多糖具有显著的体液免疫活性和增强巨噬细胞功能。郑维发等（2003）试验了盐生杜氏藻水提取物（WEDS）对小鼠细胞免疫功能的影响，结果表明，剂量为100mg/（kg·d），200mg/（kg·d）和300mg/（kg·d）的WEDS对Cy（环磷酰胺）诱导的小鼠免疫功能的增强和减弱均有显著的下调和提升作用；浓度为125～500μg/ml的WEDS对腹腔巨噬细胞分泌IL-1有显著的促进作用，超出上述范围之外浓度的WEDS对腹腔巨噬细胞分泌IL-1的促进作用显著减弱；浓度为62.5μg/ml的WEDS对体外T淋巴细胞增殖有显著的促进作用。剂量为100mg/（kg·d），200mg/（kg·d）和300mg/（kg·d）的WEDS能显著促进ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖、IL-2的分泌，其中200mg/（kg·d）的促进作用最为显著。由此得出结论：WEDS对小鼠的细胞免疫功能具有双向调节作用。
三、小球藻多糖
（一）概述
小球藻属于绿藻门（Chlorophyta）绿球藻目（Chlorococcales）卵囊藻科（Oocysteceae）小球藻属（Chlorella），是一种广泛分布的海岸带微藻。现世界上有十几种，加上变种有上百种。我国常见的种类有蛋白核小球 藻（Chlorella pyrenoidosa）、普 通 小 球 藻（C.vulgarls）和椭圆小球藻（C.ellipsoidea）（图2-9～图2-11）。小球藻在自然界分布广泛，生物量大，能利用光能自养，也能在异养条件下利用有机碳源进行生长、繁殖。小球藻体内含有丰富的生物活性物质，如不饱和脂肪酸、色素、蛋白质、多糖等。近年来的研究证实，小球藻多糖具有增强免疫、防治消化性溃疡、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化等方面的生理活性，已成为人们研究的重点。
图2-9 蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的外部形态
图2-10 普通小球藻（C.vulgarls）的外部形态
图2-11 椭圆小球藻
（C.ellipsoidea）的外部形态
（二）提取
传统的提取多糖的方法主要有热水浸提法、碱提法和酸提法。在传统的高温、碱性或酸性提取条件下，有可能引起多糖降解，同时会使所得粗多糖颜色变深。小球藻多糖的提取过程一般包括四个步骤：破碎、浸提、分离以及纯化。对小球藻进行破碎可以更有效地将细胞壁和胞内的多糖提取出来。目前对细胞的破碎处理多采用酶解法和物理方法。其中物理方法主要为冻融法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法以及高压脉冲法。吴曼（2004）采用超声波方法提取多糖，并优化了超声条件、提取介质和洗脱条件进行；李亚清（2006）以海水小球藻作为原料，采用冻融方法提取多糖。在实际的实验操作中，为了达到更高的提取率，往往是两种或更多个方法相结合，而不是仅仅采用某一种提取方法。徐韬钧（2010）利用碱提法结合超声波破碎得到小球藻多糖。魏文志（2012）等将超声波与冻融法结合，并优化了相关的影响因素，超声波作用时间6min，冻融-超声2次和超声波功率600W，粗多糖得率达到5.92%。
（三）分离和纯化
小球藻粗多糖的精制需要经过多步骤的除杂、纯化，包括脱除色素、沉淀蛋白质等。盛建春（2007）选用超滤、DEAE C-52及Sephadex G-100柱色谱从粗多糖中进行纯化，得到两个主要组分。刘艳（2001）采用Sephadex G-75凝胶柱对粗多糖进行分离，醋酸纤维素膜电泳实验证实，得到具有不同分子量的两种多糖。
（四）小球藻多糖的生物活性
1.抗肿瘤活性
小球藻多糖具有多种生物活性，其抗肿瘤活性已经成为人们关注的热点。徐韬钧（2010）采用体外抗肿瘤实验，用免疫细胞化学、MTT、双苯并咪唑染色等方法分析了不同浓度的小球藻多糖对肝癌细胞的作用，结果显示，一定浓度的小球藻多糖能显著抑制肝癌细胞SMCC-7721的增殖。除此之外，小球藻多糖还对艾氏腹水癌白血病L-120、Meth A肿瘤以及腹水肝癌AH44、AH41c显示了抗肿瘤活性。盛建春（2007）采用体外抗肿瘤实验，用MTT法分析了两个纯化小球藻多糖组分的活性，结果证实两种多糖均对肿瘤细胞具有毒性。作为传统的抗癌药物，5-氟尿嘧啶（5-Fu）在发挥功效的同时也会破坏人体的正常免疫功能。从小球藻中提取的多糖不仅具有很高的抗肿瘤活性，而且天然无毒性，有可能开发成为一种新型的抗癌药物。
2.抗菌活性
刘四光（2007）以小球藻作为材料，从中提取得到两个多糖组分，对其开展了抑菌实验，结果显示，两个多糖组分对不同的海洋细菌都有抑制作用，且有一定针对性。陈晓清（2005）利用纸片法对小球藻粗多糖开展了抑制真菌和细菌研究，结果显示，在供试的7种真菌中，小球藻粗多糖能显著地抑制其中6种真菌（包括3种植物病原菌）。小球藻粗多糖能抑制大部分供试细菌，表现出一定的广谱性。
3.免疫活性
王凌（2012）观察了小球藻多糖对小鼠体外免疫细胞功能的影响，结果显示小球藻多糖可以促进腹腔巨噬细胞及脾淋巴细胞的增殖。施瑛（2005）采用动物试验对蛋白核小球藻多糖的调节免疫力功能进行了评价，结果显示其对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞吞噬作用均有一定的促进作用。
4.其他生物活性
小球藻多糖有一定降血糖作用。人体中碳水化合物转化的关键酶之一是α-淀粉酶，这类酶的活性对于人体对淀粉等碳水化合物的吸收起到关键作用（2013）。相关的研究表明，作为α-淀粉酶抑制剂，小球藻多糖能够抑制食物中淀粉和其他碳水化合物的水解。
四、褐藻糖胶
（一）概述
褐藻糖胶（Fucoidan），又称岩藻聚糖或含岩藻糖的硫酸多糖（fucose-containing sulfated polysaccharides），主要来自海带（Laminaria japonica）、羊栖菜（Hizikia fusifarme）、裙带菜（Undaria pinnatifida）、巨藻［Macrocystis pyrifera（L.）Ag］、墨角藻（Fucales）等海藻（图2-12～图2-16）。
图2-12 海带（Laminaria japonica）的外部形态
图2-13 羊栖菜（Hizikia fusifarme）的外部形态
图2-14 裙带菜（Undaria pinnatifida）的外部形态
图2-15 巨藻［Macrocystis pyrifera（L.）Ag］的外部形态
图2-16 墨角藻（Fucus vesiculosul L.）的外部形态
褐藻糖胶是一种杂多糖，除含有岩藻糖和硫酸基外，还含有半乳糖、木糖、甘露糖和糖醛酸等。不同生长季节的海带褐藻糖胶的含量也有所不同，7～12月含量较高，3～4月含量较低。另外，褐藻糖胶的含量与海藻的部位有着密切的联系，海带叶片中褐藻糖胶的含量，从尖部到基部逐渐降低，从1.34%降至0.14%，而中间又比边缘低。褐藻糖胶的含量在不同种属的海带也有所不同，褐藻糖胶的含量在海带中一般为0.3%～1.5%。已有文献报道，从海带中获得的褐藻糖胶具有较好的抗肿瘤和解毒重金属作用，其在抗凝血以及降血脂方面的功效也有所发现，其对HIV等的治疗也表现出一定的作用，对慢性的肾功能衰竭辅助治疗也起到令人意想不到的效果（王婷婷，2015）。褐藻糖胶的这些功能已引起科研工作者的兴趣，目前已成为海岸带药物研究的重点之一。
我国科研人员对褐藻糖胶的研究始于20世纪80年代。韩华等（2006）对羊栖菜、海带以及紫菜3种褐藻中的硫酸化多糖进行了分离提取，并检测了其体外抗氧化活性，结果显示不同溶剂提取得到的硫酸化多糖抗氧化作用也存在明显的不同，而水提的羊栖菜多糖（褐藻糖胶）表现出更为显著的抗氧化活性。褐藻糖胶在慢性肾病及肾衰的治疗中表现出较好的效果，具有降低慢性肾衰患者的血肌酐、尿素氮的作用，从而使肾功能得到改善，使病情的进展得到延缓。张全斌等（2004）采用低温损伤和肾切除引起的肾功能衰竭模型观察了褐藻糖胶对慢性肾功能衰竭（CRF）的影响，结果显示当剂量为100mg/kg、200mg/kg时，灌胃褐藻糖胶均能使尿素氮和血清肌酐的水平显著降低，从而可以保护两种模型小鼠的肾。研究还发现褐藻糖胶可以显著清除超氧阴离子，其IC50为20.3 μg/ml，但对DPPH有机自由基和羟自由基的清除作用相对较弱。另外很多研究证实，来自羊栖菜、海带中的褐藻糖胶表现出抗凝血作用。赵雪等（2011）以海带为原料，采用阴离子交换以及自由基降解的方法制备得到不同硫酸基含量与分子量的褐藻糖胶组分，通过凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血时间以及血浆复钙时间等为指标，测定了褐藻糖胶的抗凝血活性的构效关系，发现高分子量和高硫酸基含量的褐藻糖胶具有较好的抗凝血活性，且分子量对抗凝血活性的影响较大。另外褐藻糖胶的体内抗肿瘤以及免疫调剂活性也有所报道。陈静（2006）采用超声波破碎法对马尾藻中的褐藻糖胶进行了分离提取纯化，并研究了其对S180及H22体外及小鼠体内的影响进行了评价。
有关褐藻糖胶的研究在国外开始较早，早在1913年，Kylin首次以掌状海带作为原料，提取得到了主要以岩藻糖硫酸酯作为主要组成成分的多糖，另外还含有少量的木糖、甘露糖、半乳糖等其他单糖，并将其称为Fucoidan（褐藻糖胶）。1957年，Springer等报道以墨角藻为原料，分离得到褐藻糖胶，活性实验证实该多糖具有抗凝血作用。以后研究人员又陆续从另外几种褐藻中提取得到了褐藻糖胶，这些多糖均表现出抗肿瘤、抗血栓作用。Iizima-Mizui等（1988）以褐藻中的马尾藻为原料，提取得到的褐藻糖胶表现出明显的抗肿瘤作用。褐藻糖胶可以诱导细胞凋亡，是通过激活人乳腺癌细胞MCF-7的Caspase-8（半胱天冬酶）来实现的（Yamasaki等，2012）。Alsac等（2012）报道褐藻糖胶可以干扰牙龈卟啉单胞菌引起的动脉瘤的扩散，多糖组大鼠肿瘤直径明显小于对照组。进一步的研究显示，这种干扰是通过降低中性粒细胞活性来实现的。Yamasaki（2012）等人报道褐藻糖胶能够作用于细胞表面，通过抑制β1-整合素基因的表达使肿瘤细胞的生长得到抑制，褐藻糖胶引导的细胞凋亡活动是由于β1-整合素是通过抑制Caspase-8来实现的。尽管传统的抗肿瘤药物像环磷酰胺、5-氟尿嘧啶等对肿瘤细胞有较为明显的抑制作用，但是这类药物在杀死肿瘤细胞的同时也会对受药机体免疫系统造成损伤，使得众多癌症患者在成功抑制了肿瘤细胞扩散与生长的同时，受到了各种药物带来的副作用。几年来有报道褐藻糖胶对机体是一种很好的免疫调节剂，Jeong等（2012）报道褐藻糖胶对5-氟尿嘧啶诱导的细胞损伤的作用，通过流式细胞仪的分析显示，褐藻糖胶能一定程度地保护细胞。Ale（2011）报道褐藻糖胶可以直接作用于黑色素瘤细胞与肺癌肿瘤细胞，抑制其生长，这种抑制作用在小鼠体内及体外都能够。Souza（2007）采用体外抗氧化实验考察了提取自墨角藻Fucus vesiculosus褐藻糖胶组分、食品工业中常用到的λ-卡拉胶、κ-卡拉胶、ι-卡拉胶以及扇藻中两个脱氧半乳聚糖组分抗氧化效果，这6种硫酸化的多糖均表现出清除羟自由基的作用，褐藻糖胶则表现出比其他组分更为显著的效果，λ-卡拉胶、κ-卡拉胶、ι-卡拉胶对羟自由基的IC50分别为0.046、0.332和0.112mg/ml，褐藻糖胶的IC50为0.058mg/ml。
（二）提取
目前海带中褐藻糖胶的提取方法主要有水提取法、酶提取法、超声波法、酸提取法以及季铵盐法等各种提取方法，有时也根据所采用原料的不同或者多糖理化性质、结构的差异联合采用多种提取方法。
1.水提取法
褐藻糖胶是一种带有硫酸基团的水溶性多糖，在提取过程中主要溶剂为水，因此可采用水冷提或热浸的方法得到其水溶液。水提取法既可以在恒温水浴中进行，也可以在室温下进行，还可先在室温下提取，再采用加热的方法。然而考虑到多糖是一种具有生理活性的大分子物质，在采用高温时有可能引起分子链或分子结构的破坏，因此一般情况下提取温度不能超过70℃。
Tatiana等（1999）将新鲜褐藻分别用乙醇、丙酮和氯仿依次处理，在此过程中大多数脂类分子被除掉，再经脱盐和干燥得到干藻粉。接着将4～5L蒸馏水加入200g干藻粉中，在60～70℃水浴环境中进行抽提，提取液上Polychrome-1型疏水树脂柱（7cm×70cm），随后依次用藻馏水、5%乙醇和15%乙醇进行洗脱，分别收集得到FA，FL，L三个组分，向FA组分中慢慢加入40%组分体积的冰醋酸沉淀即为褐藻胶，在上清液中加入乙醇至80%体积浓度，沉淀即为褐藻糖胶。Kimiko等（1966）以坛状鹿角菜为原料提取褐藻糖胶。先向200g干藻粉中加入11倍体积的85%甲醇回流2h，并重复4次，在此处理过程中一些低分子量的物质（如色素、甘露醇等）就可以被除去，干燥后得到的脱脂干粉的重量为80g，氮元素的含量由处理前的1.3%降至0.3%。加1～3L水于100g脱脂干粉中沸水提取2.5h，离心所得沉淀再用水提取，取上清液，该操作过程重复4次并将上清液合并。所得上清液经真空干燥后溶于蒸馏水，离心将不溶物除去，接着在上清液中加入2倍体积乙醇得到沉淀，并用乙醇和乙醚依次浸洗，真空干燥得褐藻糖胶粗品34g，其岩藻糖含量为14.3%。赖晓芳等（2006）采用水提取法从裙带菜中制备褐藻糖胶，用乙醇分步沉淀法进行了初步纯化，并采用Sevag法去除了多糖中的蛋白质，结果显示提取褐藻糖胶的最佳提取时间为8h，最适宜温度为80℃，在优化提取条件下，其得率可达11.62%。
2.酶提取法
酶提取法是一种新型的较为温和的提取多糖的方法，对于多糖的结构不会造成破坏，可高效地获得生物活性多糖，也可扩大规模用于工业化生产。和热水提取法相比，酶提取法能使多糖的提取率显著地提高，另外蛋白酶在多糖提取中提高多糖得率和脱除蛋白效果方面要好于Sevag法和酸法。崔艳丽等（2009）以野生裙带菜为原料，采用复合酶法提取褐藻糖胶，并对提取优化了酶解条件，结果显示，在优化条件（酶解温度为30℃，酶用量为1%，酶解时间为1.5h，pH为3.5）下，褐藻糖胶提取率达到13.9%，多糖和硫酸根的含量分别为30.24%和21.25%。
3.酸提取法
褐藻中的多糖除含有褐藻糖胶外，还有褐藻胶（即海藻酸钠）及少量褐藻淀粉。酸提取法就是利用在较低的pH下褐藻胶难以溶解的性质，来得到褐藻糖胶。在稀盐酸溶液中由于大部分的褐藻胶未溶解，而褐藻糖胶处于溶解状态，因此可将褐藻糖胶提取出来，采用此法能得到较高纯度的褐藻糖胶。但是在酸性环境下褐藻糖胶容易发生部分降解，从而使分子结构遭到破坏，所以采用该法提取时间不宜太长，以尽可能保持其分子的天然状态。Neill等（1954）以墨角藻（F.vesiculosus）为原料，采用稀酸提取得到褐藻糖胶，其操作过程如下：加2L稀HCl溶液（0.17mol/L，pH2.2）于200g干藻粉中，于65℃下反复抽提3次，每次抽提前需将pH调到2.2，每次处理1h，合并提取液后离心，取上清液并用碱调至中性，用旋转蒸发仪减压蒸干，溶于蒸馏水中并将不溶物去除，加乙醇至30%浓度，离心取上清液，上清液加乙醇60%浓度，离心后沉淀经干燥即为褐藻糖胶粗品。樊文乐以脱脂海带为原料，分别采用水浸提法和酸提取法提取褐藻糖胶，并对提取工艺进行了优化，两种方法粗多糖提取率分别是9.29%和8.10%。作者进一步从黏度、产率、红外光谱图和抗氧化性等多方面对两种方法提取的褐藻糖胶进行了比较，两种方法各有优劣：水提取法产率较低、需要料液比大，且提取液中含有的褐藻胶较多，不利于进一步的纯化，但水提取法得到的产品表现出较强的抗氧化活性，并较好地保持了原有的分子状态；酸提取法多糖得率较高，但褐藻糖胶会发生水解，从而使原有的大分子结构被破坏。
4.超声波提取法
超声波穿透能力强，方向性好，利用超声波振动传递的能量，可改变物质的组织结构、状态、功能或加速这些改变的过程。超声的空化效应使得超声波能缩短提取时间，提高多糖的得率，降低提取液黏度（唐志红等，2013）。贲永光等（2010）以海带为原料，优化了褐藻糖胶的超声波提取工艺。结果显示，影响超声波提取的先后顺序依次为超声时间、固液比、提取时间和超声功率，在优化条件（超声功率为32W，超声时间30min，提取温度为40℃，固液比1∶30）下褐藻糖胶提取率达到19.89mg/g。周军明等（2006）采用超声波辅助热水浸提法提取褐藻糖胶，同时优化了褐藻糖胶的超声波提取工艺，在超声功率800W条件下超声60min，加蒸馏水于固体残渣中90℃提取4h，离心后将上清液合并，接着对提取液采用乙醇分级沉淀处理，去除20%组分，得60%多糖组分即为褐藻糖胶粗品。此过程中采用超声波细胞破碎仪，条件设置为保护温度80℃，间隔时间2s，超声时间5s。在此优化条件下，褐藻糖胶和硫酸根的含量分别为36.97%和22.49%。
5.其他提取方法
提取褐藻糖胶的方法除了上述水浸提法，酶提取法、稀酸提取法、超声波提取法外，还有微波辅助提取法、稀碱液提取法等多种提取方法（马伟伟，2013）。另外，根据实际需要，还可选用不同提取方法进行组合来提取褐藻糖胶。
（三）分离和纯化
多糖是一种活性大分子物质，分子结构组成比较复杂，从褐藻中直接提取得到的粗褐藻糖胶，通常还含有水溶性褐藻胶盐、蛋白质、无机盐、褐藻淀粉和色素等一些杂质，可通过透析或超滤除去小分子物质，Sevage法脱去蛋白，乙醇或者CaCl2沉淀法除去褐藻胶（马伟伟，2013）。一般酸提取法粗多糖适于选择乙醇和CaCl2分级沉淀法，水提取法粗多糖宜选用CaCl2沉淀法进行纯化。除杂后的褐藻糖胶组成成分依然复杂，无论是在电泳还是色谱柱上都呈现不均一状态，不同分子结构和不同分子量的褐藻糖胶的生物活性也不同，若要深入研究结构与活性间的构效关系，必须对褐藻糖胶进行分级纯化，得到褐藻糖胶的单一组分。褐藻糖胶分级纯化方法有很多，常用的方法有乙醇分步沉淀法、季铵盐沉淀法、柱层析法等（李波等，2003）。
1.季铵盐沉淀法
季铵盐沉淀法是利用阳离子表面活性剂能够与高分子电解质反应生成沉淀的性质，来使褐藻糖胶以共沉淀的形式分离出来，生成的沉淀可溶于高浓度的NaCl溶液中，再在上清液中加入一定量的乙醇将褐藻糖胶沉淀出来，通过离心干燥就可得到褐藻糖胶粗品（刘海光，2007）。季铵盐沉淀法制备的褐藻糖胶纯度较高，但回收率较低且操作步骤较为繁琐。Takashi（1989）采用热水浸提法得到褐藻多糖提取物，将其配成1%水溶液后，加入3%的十六烷基氯化吡啶，离心后取沉淀，将沉淀溶于氯化钙（4mol/L）中，37℃下静置20h，乙醇沉淀，冷冻干燥后得褐藻糖胶。伍志春等（1999）以鼠尾藻为原料，采用季铵盐沉淀法得到褐藻糖胶。该方法与乙醇沉淀法进行比较，结果显示季铵盐沉淀法与乙醇沉淀法所得多糖岩藻糖的含量分别为43.1%和20.4%，说明季铵盐沉淀法所得褐藻糖胶纯度相对较高。
2.乙醇分步沉淀法
通过酸提取法、水提取法等方法在褐藻提取得到的多糖粗提液，都不同程度地含有一些其他的多糖组分，包括褐藻胶、褐藻淀粉等。褐藻淀粉可溶于较高浓度的乙醇（体积分数大于60%），低浓度乙醇（体积分数为20%～30%）会使褐藻胶沉淀下来，采用乙醇分步沉淀法处理褐藻糖胶粗品，就可以增大硫酸多糖的纯度，去除去杂多糖组分（马伟伟，2013）。Black等（1952）先用20%乙醇处理褐藻糖胶粗品，褐藻胶组分沉淀出来，再加乙醇体积分数为60%时会得到褐藻糖胶沉淀，接着用乙醇对沉淀进行重沉淀。加乙醇至体积分数为30%，若没有沉淀析出，继续加乙醇至体积分数为70%，褐藻糖胶则会呈半胶状，加入10%的NaCl溶液1ml后，半胶状多糖会迅速絮凝，离心得沉淀，并用乙醇及乙醚浸洗，真空干燥后得到沙状颜色的褐藻糖胶粉末。Kimiko等（1966）将水提取法及酸提取法得到的粗褐藻糖胶溶于水后，加乙醇至乙醇体积分数达到20%，此时大部分的色素及褐藻胶被除去了，向上清液中加入乙醇至乙醇体积分数为50%，得到的沉淀即为褐藻糖胶，结果表明，其岩藻糖的含量在42%左右。当乙醇的浓度增大，超过65%时，就会有少量的海带淀粉从清液中析出。Anno等（1991）将褐藻糖胶粗品溶入藻馏水中，加入乙醇使其体积分数达到30%，除去沉淀物，沉淀用无水乙醇、乙醚进行清洗，干燥得到较纯的褐藻糖胶。
3.柱层析法
褐藻糖胶纯化经常使用的离子交换柱层析有DEAE-纤维素，DEAE-Sepharose CL-6B，Q-Sepharose F.F.，DEAE-Sepharose F.F.和DEAE-52，DEAE-Bio Gel Agarose等。常用的凝胶柱层析有Sepharose CL-6B，Sephadex G-200，Sephacry lS-200HR等。将鼠尾藻褐藻糖胶经DEAE-52阴离子纤维素交换层析分级可得到5个硫酸根含量不同的组分，将其中含有硫酸根的组分分别经Sephadex G-200凝胶柱层析分级纯化可得6个分子量不同的组分。Li等（2005）用DEAE-Sepharose CL-6B对羊栖菜褐藻糖胶进行分级，用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱，得到三个组分，其中得率最高的组分用Sepharose CL-6B进行进一步分级，又得到三个组分（图2-17），琼脂糖凝胶电泳显示这些组分都只有一条带，为单一组分。王华祖（2004）以羊栖菜为原料，水为溶剂粗提褐藻糖胶，分别采用DEAE-Cellulose32阴离子交换层板、DEAE-Cellulose52阴离子交换层析、DEAE-Sepliarose Fast Flow阴离子交换层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析进行纯化比对试验。
图2-17 羊栖菜褐藻糖胶的提取纯化（Li 等，2005）
（三）理化性质研究
1.物理性质
褐藻糖胶的物理性质主要包括物质性状、特性黏度以及多糖含量等指标。在自然状态下，褐藻糖胶呈现黏稠状液体，看似糖胶，干燥后呈白色（或淡黄色）粉末状（或絮状）（图2-18）。大分子的特性黏度与相对分子质量之间存在密切的联系，在一定条件下，相对分子质量越大，特性黏度就越大，因此，特性黏度的大小可反映大分子相对分子质量的高低。研究人员比较了酸提取法和水提取法所得到的褐藻糖胶的黏度，发现酸提取法提取而得的褐藻糖胶的特性黏度明显小于水提取法提取的褐藻糖胶的特性黏度，这说明褐藻糖胶在用酸提取过程中确实发生了水解，由于分子变小，因此黏度降低（马伟伟，2013）。
图2-18 褐藻糖胶的外观
2.分子量测定
未经分级纯化的多糖相对分子质量分布较广，可以通过测定其平均分子量来了解多糖分子的分子特性。测定分子量的方法有多种，包括高效液相色谱法、凝胶色谱法、藻气压渗透法、相对黏度法、端基法、光散射法、凝胶电泳法、超离心法和分子筛色谱法等。目前较为常用的是高效液相色谱法、凝胶电泳法等。赖晓芳（2006）以已知相对分子质量的Pillulan多糖做标样，采用Sepharose-4B琼脂糖凝胶法，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱测定了裙带菜中两个褐藻糖胶的相对分子量分别为550808和38335。宁亚净（2014）通过高效凝胶渗透色谱法，使用TSK-gel G-5000PWXL柱测定羊栖菜中两个纯化的褐藻糖胶组分的平均分子量，两组分的数均分子量分别为1.7万和2.4万，平均分子量分别为3.9万和5.0万。
3.硫酸基及糖醛酸的含量测定
氯化钡-明胶比浊法是一种常用的测定硫酸根含量的方法，间羟联苯法、咔唑-硫酸法常用于测定糖醛酸含量。丛建波等（2003）采用氯化钡-明胶比浊法对褐藻糖胶硫酸根含量的测定进行分析，反应产物最大光吸收波长为360nm，对同一样品在不同时间的稳定性进行分析并对重复性进行检验，这种方法灵敏度较高且较为准确。许会生等通过绘制葡萄糖和葡萄糖醛酸的标准曲线以及其相互干扰曲线，得出标准方程，从而可确定中性糖的含量以及糖醛酸含量，这种方法专属性高、准确性强，同时还可以避免不必要的干扰。
（四）组成和结构的研究
由于褐藻糖胶同时含有亲水性高的硫酸基和疏水性好的甲基等具有相反性质的化学基团，很容易吸着海藻中含有的各种成分，因此是一种难以精制的物质，而且与其他多糖相比其对酸和碱都很不稳定，不同材料或者不同方法提取的褐藻糖胶在组成和结构上也各不相同。
褐藻糖胶是一种高度不均一的硫酸酯杂多糖，组成和结构十分复杂，Pereival等在1950年从Himanthal lalorea（Lamaeus）中分离的褐藻糖胶含有半乳糖、木糖、岩藻糖和糖醛酸。Larsen等在1970年从泡叶藻分离到的产物中含有D-甘露糖、D-甘露糖醛酸、L-古罗糖醛酸、D-葡萄糖醛酸。Nishide等（1994）分析了21种日本产褐藻中褐藻糖胶的单糖及糖醛酸组分，结果显示所有褐藻糖胶的单糖组分均以L-岩藻糖为主，且都含有鼠李糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和木糖，少数含有阿拉伯糖，糖醛酸以甘露糖醛酸或葡萄糖醛酸为主，有的还含有半乳糖醛酸（表2-1）。Nishinoll等（1994）对美国Sigma公司以墨角藻中为原料制备的商品褐藻糖胶进行分析，结果显示，该商品中含有约0.4%氨基葡萄糖。Li等（2005）提取了羊角菜褐藻糖胶，该多糖主要由岩藻糖、硫酸根和糖醛酸组成，中性单糖主要有岩藻糖、甘露糖和半乳糖，还有少量的木糖、葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖。张晶晶等（2009）用PMP柱前衍生HPLC的方法测定了不同褐藻中的褐藻糖胶的单糖组成，单糖组成为岩藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸。
表2-1 几种褐藻糖胶单糖组成的比较（Nishide，1994）
（续表）
注：①Fuc.岩藻糖，Gal.半乳糖，Man.甘露糖，Rha.鼠李糖，Xyl.木糖，Ara.阿拉伯糖，Glc.葡萄糖。
②*按照气液色谱谱图计算，峰的总面积记为100%。
褐藻糖胶自被发现以来，至今已有约100年的时间，但只有50%的化学结构被确认。在褐藻糖胶中，L-岩藻糖通过α-（l，2）及α-（l，3）或X-（l，4）连接构成主链，在C2或C4位上结有复杂的硫酸基团，平均每两个岩藻糖基带有1个硫酸基。Kylin（1913）首次将褐藻糖胶从褐藻中分离出来，但由于当时实验条件有限，直至1950年，Percival 和Ross才提出了关于褐藻糖胶（来源于墨角藻Fucus vesiculosus）的结构：主要以岩藻糖为主，糖苷键主要为α（1→2）糖苷键，硫酸基取代位置为岩藻糖的C4位且每5个单元有一个硫酸化的岩藻糖支链。虽然很多不同来源的褐藻糖胶被用于生物活性的测定，但是这一结构在接下来的40多年中，依然作为唯一可用的褐藻糖胶的结构模型。Nishino和Nagumo（1991）报道了来源于褐藻Ecklonia kurome中的褐藻糖胶的结构，由于多糖的核磁谱图相对复杂，不能直接对结构进行阐述，因此他们推测褐藻糖胶的平均结构为：多糖以α（1→3）岩藻糖为主链，硫酸基取代在岩藻糖的C4位，但是并不排除在C2位存在其他的硫酸基或支链。褐藻糖胶不同结构的出现，使Patankar（1993）对来源于褐藻F.Vesiculosus中的褐藻糖胶（当时唯一的一种商业化产品）的结构进行再一次表征。Patankar（1993）借助于GC/MS甲基作用数据，对Conchie于1950年代提出的褐藻糖胶结构模型进行了修正。多糖仍然以岩藻糖为主，但是糖苷键主要以α（1→3）糖苷键为主，将核心区域岩藻糖连接硫酸基团聚合体的位置由最初的α-（l→3）替换为C4（图2-19～图2-28）。
图2-19 Conchier提出的墨角藻褐藻糖胶结构式
图2-20 Patankar提出的墨角藻褐藻糖胶结构式
图2-21 Bilan提出的枯墨角藻（Fucus evanescens C.Ag）褐藻糖胶结构模型
图2-22 两列墨角藻（Fucus distichus L.）褐藻糖胶结构模型
图2-23 齿缘墨角藻（Fucus serratus L.）褐藻糖胶结构模型
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图2-24 Checolot等关于泡叶藻（Ascophyllium nodosum）褐藻糖胶的结构模型
图2-26 绳藻（Chorda filum）褐藻糖胶的结构模型
图2-27 羊栖菜（Hizikia fusifarme）组分的结构模型
图2-28 李波的羊栖菜（Hizikia fusifarme）组分的结构模型
之后，关于褐藻糖胶的结构的研究报道也开始慢慢增多。1999年，Chizhov等报道了一种从褐藻Chorda filum中提取的褐藻糖胶（硫酸化岩藻聚糖），主链为3-连接α-L-岩藻糖残基，含有大量的α（1→2）-连接的岩藻糖残基支链，硫酸化位置主要以C4位为主，含有少量的C2位硫酸基且C2位有乙酰基取代。Nagaoka等（1999）以褐藻Cladosiphon okamuranus为原料制备出褐藻糖胶，主链也为以α（1→3）糖苷键连接的α-L-岩藻糖，硫酸化位置以C4位为主，含有C2乙酰化，但是支链为葡萄糖醛酸残基通过α（1→2）糖苷键连接。除了主链为3-连接α-L-岩藻糖残基的硫酸化岩藻聚糖之外，研究人员还发现在Ascophyllum nodosum，Fucus distihus，Fucus evanescens等褐藻中存在主链α（1→3）糖苷键连接α-L-岩藻糖残基和α（1→4）糖苷键连接α-L-岩藻糖残基交替的硫酸化岩藻聚糖。李波（2005）以羊栖菜为原料，对水提法所得褐藻糖胶粗提物进行了分级纯化和理化性质的研究，粗提物经DEAE Sephoarse CL-6B柱层析得F1、F2和F3三个级分，F3又经Sepharose CL-6B柱层析得F31，F32和F33三个级分，凝胶过滤层析及琼脂糖凝胶电泳显示F31，F32和F33为均一组分。他应用高碘酸氧化、Smith降解、部分酸水解、脱硫、羧基还原、气相色谱、甲基化分析、气-质联用以及核磁共振等方法研究了褐藻糖胶F32级分的结构，结果显示，F32的主链是由→2）-a-D-Man（1→和→4）-p-D-GlcA（1→交替连接构成的，并夹杂有少量的→4）-p-D-Gal（l→，分支点位于→2）Man（l→的3位、→4）Gal（l→的2位和→6）Gal（l→的2位。约2/3的Fuc位于非还原末端，其余的Fuc存在1，4、1，3和1，2的糖苷键；约2/3的Xyl位于非还原末端，其余的Xyl以1，4糖苷键的形式存在；Man主要以1，2糖苷键存在，且其中有2/3的Man在3位存在分支；Gal主要以1，6糖苷键存在。糖残基的构型为a-D-Manp，a-LFucp，a-D-Xylp，p-D-Galp和p-D-GlcAp。F32中硫酸基的位置为：Man主要在→2，3）Man（1→的6位；→2）Man（1→的4位和6位；Gal主要在→6）Gal（1→的3位；Fuc 的2、3、4位均存在，且有些Fuc同时存在2个硫酸基；GlcA和Xyl上没有硫酸基。F32中含有1.2%的蛋白质，糖链与肽链主要是通过还原端糖基与苏氨酸形成O-糖苷键的连接，少量的与丝氨酸连接。Bilan等（2010）报道了一种从Saccharina latissima中的褐藻糖胶的结构，存在三种结构单元：①主链是硫酸化岩藻聚糖以α（1→3）糖苷键连接，硫酸化位置为C4或C2位，支链为C2位的硫酸化岩藻糖残基；②主链为以6-连接β-D-半乳糖的岩藻半乳聚糖，支链主要为C4位的岩藻糖和半乳糖残基；③主链为以4-连接β-D-葡萄糖醛酸残基和2-连接α-D-甘露糖残基的岩藻甘露葡萄糖醛酸聚糖，支链主要为C3位的岩藻糖残基；④主链为以3-连接β-D-葡萄糖醛酸残基的岩藻葡萄糖醛酸聚糖，支链为C4位的岩藻糖残基。
（五）生理活性
近几十年对褐藻糖胶的研究已经成为开发天然海岸带药物的主攻方向和热点，褐藻糖胶的多种生物活性如免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗炎症、降血脂以及抗氧化等都有文章相继报道，对其药效机理目前还不是很清楚，但其良好的生物活性以及天然无毒副作用的性质使其拥有广阔的药用价值与开发前景。
1.肾脏保护作用
褐藻糖胶对慢性肾衰竭大鼠肾小管上皮-间充质细胞转化具有抑制作用，该作用与肾组织转化生长因子-β1（TGF-β1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）及血小板反应蛋白1（TSP-1）的表达下调和血管内皮生长因子（VEGF）表达上调有关，提示褐藻糖胶治疗可以减少腺嘌呤致肾衰竭大鼠的尿蛋白排泄，减轻肾间质纤维化，这可能部分解释褐藻糖胶的肾保护作用机制。经褐藻糖胶治疗20～30d时，血肌酐和尿素氮明显下降并随剂量增加、作用增强；同时可减少蛋白尿，对破坏的肾组织细胞有修复作用，减轻肾组织的病理损害，改善肾功能。以褐藻糖胶为主要成分的海昆肾喜胶囊对肾脏保护作用机制尚不清楚，可能与抑制肾脏内TGF-β的表达，并能减少肾脏细胞内基质Ⅳ型胶原和纤维蛋白合成，减少TGF-β、血浆酶原激活酶（IPAI-I）mRNA的表达有关（图2-29）。在给予褐藻糖胶后，缺血再灌注损伤鼠的肾血流显著提高，因此褐藻糖胶有肾保护活性。但也有研究表明，褐藻糖胶对缺血性肾损伤没有保护作用，甚至有肾毒性，结果的差异可能与动物模型的选择或药物剂量等因素有关。李杨等（2008）研究报道褐藻糖胶能够增加体重，降低糖尿病大鼠的蛋白尿，降低Scr和BUN，调节脂质代谢紊乱，可能通过抑制VEGF蛋白的过度表达，进而减慢糖尿病肾病的进程。褐藻糖胶除具有类似肝素的作用如抗血小板聚集、降低血脂、改善血液流变学等外，还通过重建受伤的肾小球基底膜负电荷屏障，防止系膜基质扩张和基底膜增生，进而减少尿蛋白量，保护肾功能。
图2-29 褐藻糖胶对TGF-β诱导细胞转化形态的影响
A.对照组细胞呈铺路石状，细胞之间具有黏附性 B.诱导组细胞之间黏附性差，细胞形态呈梭形
C.药物组细胞以上皮样细胞为主，散在梭形细胞（×400）
2.神经保护作用
Jhamandas等（2005）报道褐藻糖胶可以阻止基底前脑神经元的全细胞电流的β-淀粉样蛋白（Aβ）的诱导以及对Aβ诱导的神经毒性起到神经保护的作用。从海带中提取的褐藻糖胶对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的小鼠PD模型具有显著的神经保护作用，可使PD小鼠的行为异常得到显著改善。罗鼎真等（2009）研究发现褐藻糖胶能减轻MPP+引起的细胞损伤，对线粒体损伤引起的神经系统病变有一定的保护作用。另外褐藻糖胶可通过激活磷脂酰肌醇途径对过氧化氢诱导PC12细胞凋亡起到保护作用。李珊珊（2014）研究证实褐藻糖胶通过提高Nrf2的表达缩小脑梗死体积，对脑缺血再灌注损伤大鼠起到神经保护作用（图2-30）。
图2-30 褐藻糖胶对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响
3.抗肿瘤与免疫调节活性
褐藻提取液的抗肿瘤作用早在几百年前就已发现和利用，早期在我国民间，人们以石花菜、海蒿子、马尾藻等煎服用于治疗子宫癌和乳腺癌。食用海带居日本首位的冲绳县，癌症死亡率一直据日本最低位。褐藻糖胶是天然的和肝素类似的物质，研究表明具有抗肿瘤、能提高机体免疫力等作用。褐藻糖胶除了能通过提高机体免疫功能来抑制肿瘤细胞的生长扩散外，也可直接抑制肿瘤细胞的生长。张桂香（2001）以海带下脚料为原料，提取纯化得到褐藻糖胶，并观察了其对小鼠S180体内抗肿瘤与免疫调节作用，结果显示，褐藻糖胶具有较好的抗肿瘤作用，对实体瘤的抑制率可达30%以上。褐藻糖胶可促进巨噬细胞的增殖，并可增强其吞噬能力，激活其吞噬指数，而经过活化的吞噬细胞可以分泌促使细胞凋亡的细胞因子，从而表现出抗肿瘤活性。杨柳（2012）发现褐藻糖胶可以通过诱导Hela细胞发生凋亡，来抑制细胞的生长。Ye等（2008）通过CO2超临界萃取从马尾藻、海蒿子中提取得到褐藻多糖硫酸酯，通过分级纯化得到三个多糖组分，并对三个组分的抗氧化和抗肿瘤活性进行了测定。结果显示，三个多糖组分HepG2、A549和MGC-803对三种肿瘤细胞具有很强的抑制作用，硫酸基含量最高的SP-2具有最高的肿瘤细胞抑制活性，同时实验还发现，较低分子量的多糖组分具有较高的抗肿瘤活性。张春辉等（2008）通过MTT法检测细胞，Hoechst染色、琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡情况，以及用RT-PCR和Western检测癌细胞bcl-2与bax mRNA及其蛋白表达，研究了从海带中提取得到的褐藻糖胶对人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖与凋亡的影响。结果显示，各浓度的褐藻糖胶的溶液均能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖，效果极显著（P＜0.01），且效果与多糖的浓度成正相关，褐藻糖胶可以明显加速MCF-7的凋亡，并表现出细胞凋亡的DNA梯形条带。在褐藻糖胶存在的情况下，癌细胞中bcl-2基因mRNA及蛋白表达明显减少，bax基因的表达则增加，这说明褐藻糖胶的作用机理可能与其对基因表达有关系。Park等（2014）研究发现，一定剂量的褐藻糖胶能引起膀胱癌EJ细胞的凋亡，并且表现出剂量效应（图2-31）。
图2-31 褐藻糖胶对膀胱癌EJ细胞的凋亡作用
肿瘤发展依赖于肿瘤新血管生成。肿瘤生长和转移的前提条件就是血管生成，因此有效地阻断血管生成的步骤，即可抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的生长。Koyanagi等（2003）报道未经硫酸化修饰（NF）和经硫酸化修饰（OSF）的褐藻糖胶对人脐静脉内皮细胞的有丝分裂和血管上VEGF-165（血管内皮生长因子165）的趋化现象均有抑制作用，其中硫酸化修饰的褐藻糖胶比未修饰的多糖具有更加明显的抑制作用。在小鼠体内，硫酸化修饰的褐藻糖胶能明显抑制S180小鼠瘤细胞周围的新血管的生成，多糖的这种抑制作用在Lewis肺癌细胞以及B16黑色素瘤细胞小鼠中也能观察到。研究同时也发现，硫酸基含量对肿瘤的抑制作用也有明显的影响。褐藻糖胶对人脐静脉血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成、新生血管网、大鼠动脉环模型均有抑制作用；褐藻糖胶下调人脐静脉血管内皮细胞VEGF-A蛋白水平和mRNA。褐藻糖胶对新生血管网有抑制作用（图2-32）：400μg/ml褐藻糖胶作用内皮细胞网状结构24h和48h后没有显著变化，而对照组随着时间的延长，细胞增殖分化较快，形成了较多的网状结构，在48h时细胞长势很快，平铺整个视野。由此可见，褐藻糖胶对新生血管网有抑制作用，但其抑制作用主要表现在抑制新生血管网的增殖、分化，形成新的血管网，而不是破坏新生血管网。
图2-32 褐藻糖胶对新生血管网的抑制作用
4.抗氧化、延缓衰老的作用
Zhao等（2005）报道了海带褐藻糖胶对Cu2+诱导的LDL氧化过程的抑制作用及两种自由基的清除作用，其中低分子量的两个多糖组分能极显著地抑制Cu2+诱导的LDL氧化过程，大分子量的多糖组分抑制效果不明显。Costa等（2011）以马尾藻Sargassumfilipendula为原料，得到5种褐藻糖胶组分，并对其抗氧化性能进行了测定，褐藻糖胶组分SF-1.0v可达到抗坏血酸总抗氧化能力的90.7%，而其还原力与维生素C具有相当的能力。Cheng等（2010）模拟微胃环境对海带中提取得到的褐藻糖胶组分进行了抗氧化活性研究，发现多糖组分不仅能一定程度地清除羟自由基及超氧阴离子，而且其还原能力及亚硝酸盐清除能力也非常显著。王琪琳等（2004）将从海带中提取并降解得到的3种成分的低相对分子质量褐藻糖胶进行抗氧化实验表明，3种组分都具有显著的消除自由基的作用。董平等（2006）用H2O2对褐藻糖胶进行降解，发现降解的褐藻糖胶对超氧阴离子自由基具有显著的清除作用，而且硫酸根含量低的产物抗氧化活性好。自由基的产生可以导致机体衰老，并且可以诱导多种疾病的产生，褐藻糖胶可以显著清除脑组织中过多的氧自由基，从而降低脂质过氧化损伤的程度，减弱和阻止在常压缺氧状态下，小鼠脑组织中脂质氧化反应，从而具有抗衰老的作用。杨成君（2010）研究认为，褐藻糖胶能提高老龄小鼠GR、GSH活力，降低自由基导致的脂质过氧化。GR与其他抗氧化酶一起协同特异催化GSH对H2O2的还原反应，保护细胞膜结构与功能的完整，延缓衰老。陆艳娟等报道褐藻糖胶对老龄小鼠抗氧化酶的作用。研究显示，褐藻糖胶能够提高心、肾、脑的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）的活性，降低脂褐素（LPF）、丙二醛（MDA）的含量，与对照组相比差异显著。
5.降血压、降血脂等活性
日本学者经过长期研究发现，海带褐藻糖胶含有大量岩藻糖、糖醛酸、甘露糖等单位，能够明显降低甘油三酯和血清胆固醇的含量，并且对于肝、肾没有功能损害等毒副作用。硫酸多糖能够使血浆中的胆固醇含量降低13%～17%，能够使高密度脂蛋白含量升高16%，低密度脂蛋白减少20%～25%，还可以减少动脉粥样化指数，降低血浆中的脂质过氧化物浓度。此外，褐藻糖胶是一种类唾液酸物质，它可以通过增加细胞表面负电荷，使血液中胆固醇沉积，达到降低血清胆固醇的效果，并可促进脂肪的代谢。在褐藻糖胶对饮食性高脂血症的大鼠影响研究结果显示，给褐藻糖胶的实验组的三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）均显著降低，HDL-C显著升高。海带褐藻糖胶降解成为低相对分子质量的褐藻糖胶后，能使高脂血症大鼠血清中TG（P＜0.05）和TC（P＜0.01）含量显著降低，并提高HDL-C含量（P＜0.05）。血液中TC增加，沉积在血管壁上，能导致血管张力反射的异常以及血管内膜损伤，最终引发动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病；相反，HDL能限制动脉TC的沉积，是有效的抗动脉粥样硬化的脂蛋白，HDL-C水平与冠心病发病率成负相关。
6.抗凝血、预防血栓形成的作用
褐藻糖胶结构和肝素具有相似性，抗凝血作用是其一个突出的特点。褐藻糖胶的抗凝血活性较肝素有其独特优点，在较低浓度范围内，肝素显示出较好的抗凝血活性，褐藻糖胶的作用则较平缓，可避免类似肝素引起的出血等副作用。褐藻糖胶具有明显的抗凝血和促纤溶等生物学活性，且有剂量依赖性。由于天然提取的褐藻糖胶相对分子质量较大，不易被人体吸收，因此其抗凝血效果不及肝素显著（马伟伟，2013）。研究表明，褐藻糖胶的抗凝血效果与摄入方式有很大的关系，比如用腹腔注射的效果要优于静脉注射。Springer等（1957）首次报道从岩藻（Fucus vesieuzosus）中提取的褐藻糖胶具有抗凝血作用，此后大量的报道证实多种褐藻中的褐藻糖胶具有显著的抗血栓和抗凝血作用。Bernard等（1990）在墨角藻中制备的一种褐藻糖胶表现出抗凝血作用，但其效果低于肝素，仅为同剂量肝素抗凝血效果的15%～18%。Colliec等（1991）报道从沟鹿角藻提取的大分子量（32万）褐藻糖胶和小分子量（3000，酸水解得到）褐藻糖胶均显示出抗凝血活性。而且大分子的组分效果更好，对APTT和TT的作用分别为肝素的34.7%和23.7%。大量的研究表明，FPS具有抗血栓形成和溶解血栓的双重作用，在溶栓的同时能防止新的血栓形成，目前临床应用的抗凝血剂肝素并不具备这样的特点。Millet等（1999）对从钩角藻中提取的大分子褐藻糖胶进行酸水解，得到了低分子量的褐藻糖胶（8000），此组分通过对家兔皮下给药，显示很强的抗血栓形成活性，这种活性在注射后1～4h之间抑制活性很稳定（约为注射时的70%），在8h后效果消失。Sandrine等（1995）从泡叶藻中提取到一种具有明显抗血栓的褐藻糖胶组分，在家兔体内实验发现，当注射的褐藻糖胶达到与肝素相同抗凝效果时，褐藻糖胶作用持续时间比肝素长。褐藻糖胶具有明显的抗血栓作用，它能够抑制血栓的形成，还能增强t-PA激活纤溶酶原，从而具有抗血栓形成和溶解血栓的双重作用，目前临床应用的抗凝剂和溶栓剂都不具备这样的特点。褐藻糖胶这种双重作用在溶栓过程中防止新的血栓形成，尤其在辅助t-PA进行溶栓治疗中将有明显的效果。褐藻糖胶对内源性和外源性凝血途径均具有良好的抑制作用，连续给药后可降低血浆纤维蛋白原的含量，抑制静脉血栓的形成。
7.抗辐射作用
褐藻糖胶能使受辐射大鼠脾淋巴细胞的死亡率显著减少，并可一定程度地保护由辐射所引起的免疫系统损伤。陈乾等（2014）报道褐藻糖胶对60Co-γ射线诱发的淋巴细胞微核的产生有明显抑制作用。对小鼠腹腔注射褐藻糖胶后，用60Co-γ射线能够照射，发现褐藻糖胶对γ射线辐射引起的小鼠脾损伤有显著的抑制作用（图2-33），表现在褐藻糖胶可逆转照射引起的外周血WBC、造血干细胞、骨髓有核细胞数数量的减少及脾脏指数下降。
图2-33 褐藻糖胶对γ射线诱发的小鼠脾损伤的抑制作用（陈乾等，2014）
（a）正常对照组小鼠脾脏（b）辐射对照组小鼠脾脏（c）褐藻糖胶100mg给药对照组
8.抗病毒作用
Elizondo-Gonzalez等（2012）报道以褐藻C.okamuranus提取得到褐藻糖胶，并研究了其对早期感染鸡新城疫病毒和鸡新城疫病毒（NDV）La Sota细胞株的影响，并将其与野生NDV病毒的感染进行了比较，结果显示，褐藻糖胶可以将感染率降低48%，并且可抑制病毒HN蛋白的表达。朱文等（2006）报道以褐藻展枝马尾藻（Sargassum patens）原料，制备得到褐藻糖胶，采用MTT测定、细胞治病效应空斑形成抑制试验以及对其细胞毒性研究抗病毒活性，结果显示该多糖能很好地抑制呼吸道合胞病毒，EC50值为1.1，但不能抑制副流感病毒以及流感病毒A和B。
9.降血糖活性
海带褐藻糖胶有显著的降血糖作用，其作用具有剂量性、时效性，且高剂量组与标准药物对照组的降血糖效果在统计学上无显著差异。昆布褐藻糖胶高血糖大鼠的糖耐量有明显改善，但对血清胰岛素水平没有明显的影响。孙炜等（2004）将昆布褐藻糖胶按不同剂量连续灌胃大鼠3周后，测定糖耐量、空腹血糖、血脂等指标，发现昆布褐藻糖胶对正常大鼠血糖没有影响，但可使实验性糖尿病大鼠的血脂及血糖明显降低，糖耐量得到提高。同时，昆布褐藻糖胶能使糖尿病小鼠尿素氮和血糖明显降低，使糖尿病小鼠的血清胰岛素和血清钙含量增加，对四氢嘧啶所致的胰岛损伤具有明显的恢复作用。
10.胃黏膜保护作用
冈村枝管藻（Cladosiphon okamuranus）褐藻糖胶能抑制幽门螺杆菌对猪胃黏蛋白的黏附，在0.05%和0.5%的褐藻糖胶浓度下（饮水中）幽门螺杆菌诱导的胃炎及幽门螺杆菌感染的动物的患病数显著减少（Shibata等，2000）。
11.抗缺血作用
给鼠静脉注射低分子量褐藻糖胶显著地改善鼠残端肌肉血流，其原因是低分子量褐藻糖胶通过加强FGF-2的活性，加速缺血肢体鼠模型的血管形成（Luyt等，2003）。缺血肺的再灌注时伴随着肺血管阻力提高、肺泡灌注减少及炎症反应。研究提示在兔缺血肺再灌注时，褐藻糖胶能抑制血小板和内皮的相互作用，能提高肺泡的血流，抑制血管直径的减少（Ardrew等，2004）。
12.对基质金属蛋白酶（MMPs）的影响
MMPs降解细胞外基质，参与许多病理生理过程（章义利等，2008）。在褐藻糖胶存在的情况下，培养的皮肤纤维母细胞产生自由形式的MMPs组织型抑制剂（TIMP-1），MMP-2和MMP-3下降，MMP-2和TIMP-1或MMP-3和TIMP-1复合物的形成增加（Senni等，2006）。TIMPs和MMPs之间的相互结合力的强弱主要依赖于硫酸化多糖的电荷密度和3D结构。褐藻糖胶能减少培养液中MMP-3酶原（IL-1B诱导产生的）的释放，这可能是由于褐藻糖胶通过打乱细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖和纤维连接素之间的相互作用，从而抑制了IL-1B的信号，因此可抑制MMP-3的表达（Senni等，2006）。
13.抗血管成形术后的再狭窄作用
目前经皮冠脉腔内成形术后再狭窄率为30%，其主要原因是动脉中膜平滑肌细胞（VSMC）向内膜移行和过度增殖，因此寻找并筛选抑制VSMC增殖的有效药物成为研究再狭窄甚至动脉硬化形成的重要方法（章义利等，2008）。研究人员观察兔髂动脉血管成形术后，局部注射低分子量褐藻糖胶，多糖主要结合于损伤的血管部分，在没有血管成形术的部分则结合较低，第14天组织形态学分析表明低分子量褐藻糖胶减少内膜增生达59%，减少管腔交叉切面面积狭窄达58%，血样本显示没有因为低分子量褐藻糖胶的应用而表现出抗凝血活性（Deux等，2002）。除了抗动脉中膜平滑肌细胞增殖效应是低分子量褐藻糖胶抑制内膜增生外，另外，低分子量褐藻糖胶被细胞和器官迅速摄取后，其被摄取的速度会缓慢下降（Deux等，2002）。肌肉内给药后，延长的高血浆浓度可能也有助于LMW褐藻糖胶分子和因血管成形术后与血液成分有接触的血管平滑肌细胞上的膜受体相互作用。已知单核细胞和炎症细胞因子的激活以及黏附在支架内是再狭窄中重要的因素，褐藻糖胶可以在体内减少白细胞的迁移和中性粒细胞的黏附，抑制炎症化学因子/细胞因子的释放，从而使内膜增生得到抑制（Deux等，2002）。高分子量和低分子量褐藻糖胶具有减少血小板聚集和抗血栓形成的活性，高分子量褐藻糖胶可以使干/祖细胞的动员得到提升。因为循环祖细胞和损伤动脉的再内皮化有关，低分子量褐藻糖胶对它的动员可导致内皮增生的减少（Deux等，2002）。
14.对平滑肌增殖的影响
Patel等（2002）研究表明，褐藻糖胶在体内和体外均抑制动脉平滑肌细胞（VSMC）的增殖。有研究表明，肝素和褐藻糖胶对平滑肌细胞表面的肝素受体具有相似的亲和力，但它们执行的功能是完全不同的（Patel等，2002）。褐藻糖胶能显著抑制胎牛血清中凝血酶敏感素-1、血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）以及刺激DNA的合成，肝素对PDGF-BB诱导的DNA合成没有明显的影响。表明两者有不同的机制介导了这些活动，褐藻糖胶对肝素耐受动脉平滑肌细胞的效应及有力的抗促有丝分裂作用，表明它具有潜在的治疗作用。
研究显示（Deux等，2002），低分子量褐藻糖胶对培养的血管平滑肌细胞有高度的亲和力并集中在核周的胞饮囊泡内，表明褐藻糖胶的抗鼠血管平滑肌细胞的增殖效应是由它的结合膜位点介导，可能相似于介导肝素入胞作用。褐藻糖胶的核周聚集同时也表明它是通过细胞内信号途径抗增殖的，已经证实褐藻糖胶能减少生长因子诱导的丝裂原激活蛋白激酶的激活，阻止磷酸化的丝裂原激活蛋白激酶的核转位，从而抑制血管平滑肌细胞的增殖。McCaffrey（1994）等认为高分子量（HMW）褐藻糖胶对鼠和牛动脉培养的SMCs的抗增殖活性，和其保护转化生长因子B1免受纤维蛋白酶和胰蛋白酶的水解有关。
15.对血管形成的影响
在利用培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）研究血管结构形成的研究中，结果显示纤维母细胞生长因子（FGF）在血管形成和人脐静脉内皮细胞的迁移中起一定的作用。Koyarag等（2003）研究认为，过硫酸化褐藻糖胶对碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）诱导的人脐静脉内皮细胞迁移及血管形成有显著的抑制作用，进一步研究表明，过硫酸化褐藻糖胶能促进bFGF结合细胞表面上具有酪氨酸激酶活性并对硫酸肝素分子有高度亲和力的受体并使其自动磷酸化，结果提升PAI-1的释放，阻止伴随基质蛋白水解的细胞迁移的血管形成中起着关键作用。过硫酸化或天然的褐藻糖胶通过阻止血管内皮生长因子165（VEGF165）对人脐静脉内皮细胞（HU-VEC）表面受体的结合，对化学趋化和促有丝分裂作用有显著抑制作用，但过硫酸化褐藻糖胶比天然的褐藻糖胶具有更为显著的抑制效应，提示硫酸基团数目在褐藻糖胶分子中起着关键作用（Fisher等，2004）。过硫酸化褐藻糖胶可明显抑制植入鼠体内的肉瘤180细胞诱导的新血管形成，表明增加分子硫酸基团的数目，有助于更有效地组织血管形成（章义利等，2008）。
16.抗炎症反应
褐藻糖胶对由肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和脂多糖（LPS）刺激巨噬细胞表达的一氧化氮合酶（iNOS）具有抑制作用，因此能抑制一氧化氮（NO）释放，这可能是褐藻糖胶能进入到细胞核，对某些转录因子（如AP-1）的激活产生一定的影响，另外还可能涉及NF-KB和p38MAPK两个独立的途径，而发挥其抗炎症及调节一氧化氮表达效应（Yang等，2006）。褐藻糖胶可作为巨噬细胞清道夫受体1（MSR1）的配体，能依赖其入胞机制被摄取巨噬细胞中。研究显示褐藻糖胶刺激NO产生的主要途径清道夫受体A（SR-A）。用褐藻糖胶（10mg/kg）预处理降低了刀豆素A（Con-A）注射后鼠的肝损伤程度，这种保护效应是诱导肝组织和血浆中IL-10的产生实现的，而没有使白细胞的聚集阻止。来源于奥氏海藻（Cladosiphon okamuranus Tokida）和厚叶解曼藻（Kjellmaniella crassifolia）的褐藻糖胶能抑制鼠结肠上皮细胞株CMT-93中产生IL-6，并伴随着下调NF-JB核转位。用褐藻糖胶（来源于枝管藻Cladosiphon）处理，结肠炎鼠的髓质过氧化物酶（MPO）活性和疾病活性指数下降，结肠固有层的细胞因子IL-6、IFN-K的合成下降，转化生长因子B和IL-10上升。用枝管藻Cladosiphon褐藻糖胶喂养Balb/c结肠炎鼠，结肠上皮细胞表达的IL-6mRNA要低于正常饮食小鼠（Matsumoto等，2004）。在炎症反应中补体激活途径具有重要的作用。褐藻糖胶可抑制补体激活的经典和旁路途径，通过与胶原样区的赖氨酸残基相互作用结合C1q，接着阻止C1s（2）-C1r（2）亚单位（完全活性C1所必需）之间的结合；C4蛋白包含C1s劈开时就可外露的分子内硫脂键。这个硫脂键介导目的中性粒细胞表面和C4b的共价黏附，褐藻糖胶可以结合在易受中性粒细胞氢氧基团攻击的硫酸脂键周围，从而使C4分子不能有效地和中性粒细胞表面结合，这样褐藻糖胶就抑制了补体的激活及随后的炎症反应（章义利等，2008）。
17.对慢性电离辐射致雄性大鼠生殖功能损伤的干预作用
研究表明，在慢性电离辐射致大鼠睾丸损伤后，LJP减少了在14d恢复期间的睾丸细胞凋亡量，其机制同海带多糖有效调控受损睾丸细胞内的Ca2+浓度有关；有研究表明，Ca2+浓度升高可激活钙依赖蛋白酶，促使胞内许多重要酶降解，也促使了细胞骨架成分的降解，加快了胞内黄嘌呤脱氢酶向参与氧自由基合成的黄嘌呤氧化酶的转变；浓度升高还可激活钙依赖性核酸内切酶，引起DNA水解，阻断胞内依靠转录而进行的潜在修复过程。所以提示海带多糖的干预阻止了受损睾丸细胞内的Ca2+浓度升高，防止了黄嘌呤氧化酶的增多，减少了胞内氧自由基的合成，避免了辐射对睾丸细胞的脂质过氧化损伤；同时降低了核酸内切酶的活性，提高了DNA的修复。海带多糖对受损睾丸细胞内Ca2+浓度的有效调控，还防止了线粒体内膜腺苷酸转运蛋白（adenille nucleotidetransfocato，ANT）构象发生改变，进而阻止了线粒体通透性转换孔（permeabilitytransitionpore，pTp）的持续开放，避免了线粒体内膜两侧离子梯度消失，呼吸链和氧化磷酸化脱偶联，线粒体基质渗透压升高，内膜肿胀而造成的线粒体崩解；进而减缓了线粒体膜间隙的细胞色素C细胞凋亡诱导因子（apoptosis indued factor，AIF）和Caspase蛋白酶原等的释放，最终减少了通过凋亡级链反应引发的睾丸细胞凋亡数量（刘军，2010）。
18.抗动脉粥样硬化活性
研究发现（张秀坤，2009），口服褐藻糖胶可以对内皮细胞有保护作用，阻止动脉粥样硬化病变的形成和发展。模型组大鼠在实验结束时肝脏光镜下观察肝细胞排列紊乱，脂肪空泡明显增多，有的胞核被挤至一侧；高剂量组褐藻糖胶大鼠肝脏的脂肪性变有所减轻，提示高脂膳食可导致肝脏脂肪变性及AS形成，一定量的褐藻糖胶具有减轻脂肪肝的作用（图2-34）。
图2-34 口服PSS对内皮细胞有保护作用（张秀坤，2009）
（六）褐藻糖胶的构效关系研究
褐藻糖胶由于其广泛的活性而深受关注，又由于其结构的复杂多样性以及相应分析技术的落后，十分明确的褐藻糖胶的构效关系仍然没有建立起来。
1.分子量对活性的影响
Shimizu（1999）等通过测试口服不同分子量的褐藻糖胶的活性发现，与低分子量褐藻糖胶相比，口服高分子量的褐藻糖胶可以增加脾脏细胞CD8的表达和CD11b细胞的数量，同时使CD4/CD8的比例逐渐下降。Azofeifa等（2008）发现褐藻糖胶在有响尾蛇毒液的条件下，可以抑制肌肉磷脂酶A2。因此，他们研究低分子量的褐藻糖胶和粗褐藻糖胶，结果发现高分子量的褐藻糖胶在体内具有治疗蛇毒的作用，然而低分子量的褐藻糖胶没有活性，尽管两者在体外具有相同的活性。上述文献报道了高低分子量的褐藻糖胶的活性差异，而Park等（2014）的研究成果更有意思，他们测定了高、中、低分子量的褐藻糖胶在关节炎模型中的活性，结果显示高和低分子量的褐藻糖胶的结果明显相反（高分子量组分具有活化炎症的过程，低分子量组分则为抑制关节炎的作用）。Nakazato等（2010）在测定口服褐藻糖胶（粗褐藻糖胶和高分子量的褐藻糖胶）在肝中的浓度时，发现口服高分子量的褐藻糖胶具有抑制肝纤维化的活性，且口服高分子量的褐藻糖胶的活性远远高于未分级的粗褐藻糖胶的活性。
2.硫酸化位置和硫酸化程度对活性的影响
褐藻糖胶抗凝血活性不仅与分子量有关，而且还与硫酸化程度和方式有一定联系。Ferial等（2000）报道低分子量的硫酸化褐藻糖胶（硫酸根含量不同）的抗恶性细胞增生活性和抗凝血活性都与硫酸化程度有关。他们发现抗凝血活性和抑制细胞增生的活性都与硫酸化程度有关，硫酸根含量降低，两者活性都降低，但是以不同的方式降低，一些低分子量的硫酸化褐藻糖胶虽然没有抗凝血活性，但仍对恶性细胞增生起抑制作用。Mariana等（2005）报道了2-O-硫酸化岩藻糖的存在可一定程度地降低抗凝血活性，推测抗凝血活性不仅是由于多糖的电荷和硫酸化程度，而主要与多糖和凝血因子及靶标蛋白的立体选择性有关。Takeshi等（2007）对比了粗褐藻糖胶（硫酸根含量13.5%）和过硫酸化褐藻糖胶（硫酸根含量32.8%）的抗恶性细胞增生的活性。粗褐藻糖胶的硫酸化方式主要为C 4位，而过硫酸化褐藻糖胶有C 2和C 4双硫酸化、C 2和C 4位硫酸化三种方式；过硫酸化褐藻糖胶活性较强，且呈浓度依赖型而粗褐藻糖胶活性较弱。Karmakar等（2009）也发现了进一步的硫酸化可以大大地增加体外抗单纯疱疹病毒的活性。
3.结构复杂性对活性的影响
Pereira等（2002）报道了硫酸化3-连接的半乳聚糖能通过肝素辅助因子Ⅱ或抗凝血酶，从而作为潜在的凝血酶抑制剂，但是作为结构相似的2硫酸化3-连接的岩藻聚糖并没有这一活性，同时发现硫酸化半乳聚糖分子量的微小变化，会大大地降低抗凝血酶活性，这一结果说明单糖的种类也会影响其活性。早在1999年，Pereira等人对来源于三种不同褐藻的硫酸化岩藻聚糖（褐藻糖胶）和重复的有规律的硫酸化岩藻聚糖（来源于无脊椎动物）抗凝血活性进行了比较，发现不同的结构特征不仅决定其抗凝血能力，而且对其发挥活性的机制有重要的影响，褐藻糖胶的支链对其活性也有重要的影响，葡萄糖醛酸支链的存在会使抗凝血活性降低，但抗病毒活性却与葡萄糖醛酸支链密切相关。
（七）褐藻糖胶应用与开发现状
褐藻糖胶在抗凝血、抗肿瘤、抗HIV、抗血栓、提高免疫力、降血脂等方面具有独特的功效，是陆地植物成分所无法比拟的，因此褐藻糖胶已成为当今天然药物主攻的重点之一。而且褐藻糖胶来源丰富，成本低廉，在美国、日本作为预防和治疗血栓及癌症疾病的药已进入市场。挪威和德国也开展了褐藻糖胶在抑制白细胞生长及抗HIV方面的研究。我国是世界上海带栽培量最大的国家，为褐藻糖胶的开发提供了丰富的资源。但是褐藻的种类和提取方法的不同，造成褐藻糖胶的化学性质和活性差别很大，褐藻糖胶的化学性质，尤其是分子量、硫酸根含量和岩藻糖含量对它的活性影响很大。目前关于海带、泡叶藻、墨角藻、羊栖菜、昆布、钩鹿角藻、微劳马尾藻、鼠尾藻等海藻中提取的褐藻糖胶的结构和活性已经有了很多的研究报道，但是对低分子量褐藻糖胶的研究还少。
近几年，褐藻糖胶的开发利用也开始日益得到国内外医药企业的重视，提取植物来源包括海带、裙带菜、墨角藻等大型褐藻类物质。最主要的来源是海带，其次是裙带菜。目前主要供应的褐藻糖胶产品规格50%、85%等，国内销售这两个产品的企业主要集中在宁波、北京及陕西三地。不同货源价格也相差甚大，产品质量良莠不齐。另一方面，现今行业内对这些产品也缺少统一的质量检测及评定标准，致使假劣货横行。根据最新的市场调研，目前国内市场能供应合格产品的公司不超过3家，国际市场也不超过8家，其中日本是走在最前列的。一般而言，褐藻糖胶50%、85%规格价格也分别在每千克200美元及280美元，经济价值相当可观。
五、褐藻胶
（一）褐藻胶的来源与结构
褐藻胶（alginate，alginic acid）又被称为褐藻酸、海藻胶等，是一种酸性杂多糖。主要来源于如海带（Laminaria yajwwca）、马尾藻（Sargassum）、巨藻（Macrocystis pyrifera）、掌状海带（Lamimria digitata）、巨大昆布（Ecklonia maxima）和瘤状囊叶藻（Ascophyllum nodosum）等海产褐藻的细胞壁中，占海带干重的30%～40%，多以镁盐和钙盐形式存在。另外，一些陆地或海岸带微生物也可以合成褐藻胶，目前研究发现假单胞菌属（Pseudomonas）和固氮菌属（Azotobacter）两个属的细菌能够合成褐藻胶。
褐藻胶是由a-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronate，G）与β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate，M）两种单体构成（图2-35），通过1，4糖苷键连接而成的线性多糖。褐藻胶所含糖苷键可能有4种构型，分别为双直立键（diaxial，GG）、双平伏键（diequatorial，MM）、直立—平伏键（axial-equatorial）以及平伏—直立键（equatorial-axial，MG），双直立键使得围绕糖苷键的旋转受到阻碍，可能这就造成了褐藻胶链的伸展性和刚性。研究显示褐藻胶分子中存在的序列模式有三种情况，分别为聚古罗糖醛酸片段（Polyguluronate， PG）、聚甘露糖醛酸片段（Poly-mannuromte，PM）和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸杂合片段（MG blocks PMG）（见图2-35）。
图2-35 褐藻胶结构示意图
（a）monomer of M or G.（b）alginate conformation.（c）blocks of PM， PG and PMG.
不同来源的褐藻胶在组分和结构上也有很大的不同（表2-2）。即使是在同一藻体内处于不同组织的褐藻胶，其结构和组分也存在一些差异，组织的机械强度和柔韧性与该部分M/G的比例密切相关。例如，在Laminaria hypeiborea中有较大机械强度的根部和叶柄含大量古罗糖醛酸，其中在老叶柄外表皮中分离得到褐藻胶中古罗糖醛酸占绝对优势。具柔软质地的叶片中则古罗糖醛酸组分含量较少，甘露糖醛酸组分含量很高。另外，在瘤状囊叶藻子实体和细菌中可以分离到的褐藻胶几乎完全为甘露糖醛酸组成。来源于细菌的褐藻胶在C2和/或C3位置处有0-乙酰化修饰，这与来源于褐藻的褐藻胶在分子水平有重要的不同（Skjak-Braek等，1986）。
表2-2 不同藻类褐藻胶组成和序列参数（Smidsrod and Draget，1996）
（二）褐藻胶的性质
纯的褐藻胶为棕黄色到白色粉末、颗粒或纤维。纯的褐藻胶能与磷酸盐、多糖、淀粉、甘油、蛋白质类共溶，但在水中几乎不溶，也不溶于四氯化碳、乙醇等有机溶剂。大分子的褐藻胶盐在水中是可以溶解的，但在高浓度无机盐存在时能够出现盐析作用，褐藻胶盐会析出并断裂。其中含较高非均聚MG模块的褐藻胶不易沉淀析出，而含有较多均聚模块（PM或PG）的褐藻胶盐在盐溶液中更易析出。另外，褐藻胶盐的溶解度也受到溶液pH的影响，这是因为溶液pH影响了糖醛酸残基所带的静电荷。褐藻胶的降解也与pH密切相关，褐藻胶盐在pH接近中性时的降解最少，降解速率在pH小于5或大于10时明显加快。一般来说，在60℃以下褐藻胶比较稳定，但温度的升高会导致褐藻胶发生解聚作用。褐藻胶可与多价阳离子相结合形成凝胶，提高褐藻胶中古罗糖醛酸含量，能够显著增强某些金属离子（如Mg2+，Ca2+）与褐藻胶之间选择性的结合（Siewetal，2005）（图2-36）。
图2-36 聚古罗糖醛酸与钙离子形成卵盒（egg-box）构象
由于古罗糖醛酸聚合模块结合二价阳离子相对容易一些，所以古罗糖醛酸含量高的褐藻胶形成的胶体刚性更强，具有更好的机械性能（图2-37），在实际应用中有更好的用途（Mooney，2012）。
图2-37 不同成分的褐藻胶与钙离子形成的胶体刚性对比（Mooney，2012）
（三）褐藻胶的降解
寡糖除了具有安全无毒、稳定性高及溶解性强等特性外，还具有重要的生物学活性。除抗病毒、抗肿瘤作用外，寡糖类物质还有抗炎、解毒和整肠、降血脂、降血糖、抗凝血、免疫调节、抗菌、抗AIDS等作用（窦勇，2009）。海岸带生物寡糖是一种可溶性纤维，可以在肠道内充分水化，引起凝胶过滤系统形成。因此，改变或延缓营养物质的消化吸收，碳水化合物的摄入量减少，所以可制成降糖素，对肥胖症、高脂血症和糖尿病起到消饥代食、减肥和降血糖的作用，并能对老年习惯性便秘有一定的治疗作用（宠敏，2007）。褐藻胶是天然高分子化合物，其降解产物——褐藻胶寡糖在现实中应用已经得到。近年来，由于寡糖功能性质和生理活性不断被揭示，且由于价格低廉，褐藻胶日益受到重视，已成为人们关注的热点。
褐藻胶降解方法有物理降解法、酶解法和化学降解法等方法。目前普遍采用的是稀酸水解法，但是这种方法需要高温、高压，降解条件难以控制，操作较复杂；由于是非特异性降解，分子量分布广，产量低，产物不好控制，有时得到大量单糖；并且制备过程中因为化学变化，产物可能有毒性，但简便易行，适于工业化生产。酶法降解褐藻胶条件温和，酶有着催化效率高、专一性强、得率高达100%等特点，因而酶降解应是一种优先选择的降解方法。酶降解褐藻胶更容易制备寡糖，这种降解不仅提供序列信息，而且能提示异头构型的产褐藻胶酶菌株的筛选、发酵条件优化和酶学性质研究信息，因此褐藻胶酶的研究近年来受到重视。故有待于以酶降解法取代酸水解法，从而使褐藻胶盐多糖酶解产物——褐藻胶寡糖在工业、农业、医药等领域发挥更大的作用，实现其更广阔的应用价值。
（四）褐藻胶及其寡糖的生物活性
褐藻胶分子所特有的结构是聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸片段，在自然界尚未发现单独存在的此类分子，这类化合物具有非常特别的性质。近年来的研究显示褐藻胶寡糖有免疫调节、抑制肿瘤、促进生长等生物活性，可将其开发成具有特殊疗效的药物，有重要的研究和利用价值。
1.免疫调节活性
具有特定分子量的褐藻胶寡糖能刺激如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞等各种免疫活性细胞的分化、成熟、繁殖等，能够恢复和加强机体的免疫系统，通过免疫调节作用，褐藻胶寡糖能发挥多种生理活性（Otterlei等，1991）。他们研究表明，褐藻胶及其降解产生的寡糖可以诱发人单核细胞大量产生某些免疫因子，如TNF2a、白介素IL26和IL21P等，在抗菌、抗病毒中起着重要作用。其中，主要的激发因素是M组分，M含量的高低与巨噬细胞作用的强弱有密切关系。褐藻胶寡糖还可作为小鼠B淋巴细胞的有丝分裂原，促进小鼠B细胞的增殖，能刺激淋巴细胞转化，增强小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬能力与体液免疫功能。
2.促进生长作用
近年来有关褐藻胶寡糖生物作用的研究热点之一是其对植物的促生长作用（Wong等，2000）。无论是利用经过酶解褐藻胶得到的寡糖，还是通过射线照射降解得到的寡糖，具有特定分子量的褐藻胶寡糖都能够促进某些植物的生长。例如，褐藻胶寡糖混合物（相对分子量小于1万）具有明显促进水稻和花生生长的作用（Quoc等，2000）。二至八糖的褐藻胶寡糖处理过的莴苣根生长长度2倍于空白组（Iwasaki和Matsubara，2000）。在植物体内褐藻胶寡糖也是重要的信号分子（Kawadaeta，1997），除了能够促进植物的生长作用外，还能够提高植物对病虫害的抵抗力。
3.抗肿瘤
研究显示褐藻胶寡糖有良好的抗肿瘤活性。这种活性不是通过细胞毒性来实现的，而是通过激活和促进非特异性免疫或特异性免疫系统，例如褐藻胶寡糖能够激活巨噬细胞，激活后的巨噬细胞表现出细胞毒素作用，进而杀死肿瘤细胞从而起到抑制肿瘤的作用。经酶解褐藻胶后得到的M/G寡糖片段处理人单核细胞后会产生细胞毒素，能够使人白血病U2937细胞生长受到抑制（Ivamoro等，2002）。由于褐藻胶寡糖对正常细胞不会造成损伤，因此没有细胞毒性，这与当前普遍使用的药物有很大的不同，即褐藻胶寡糖能够提高机体对肿瘤细胞的抑制作用，是通过提高免疫系统的功能来实现的，因此在抗肿瘤药物开发方面具有良好的前景。
4.抗凝血
近年来的研究显示，将大分子类肝素硫酸多糖转变为低分子量寡糖时，副作用大大降低，但仍然保持其生物活性。静脉注射一种低分子量硫酸寡糖类药物——新型抗脑缺血海洋候选药物989，能够抑制对静脉和动脉血栓的形成，对由花生四烯酸和胶原诱导的大鼠血小板聚集有明显的抑制作用，能使激光致小鼠肠系膜微血栓出现时间显著地延迟，并可使花生四烯酸引起的小鼠肺栓塞的死亡率降低（辛现良等，2001）。褐藻胶寡糖无毒副作用，同时有良好的抗凝作用，而且有可能大规模的人工合成，为寡糖抗凝血药物开发开辟了一条新思路。
5.抗自由基氧化
褐藻胶寡糖不仅能使脂质过氧化物的含量显著降低，而且能够清除活性氧自由基，提高超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性，表现出一定的抗氧化作用。孙丽萍等（2005）报道褐藻胶寡糖A1、A2和A3对羟自由基、超氧阴离子自由基和次氯酸等自由基的清除作用，结果显示三种褐藻胶寡糖均有较好的清除自由基的作用，而且随糖浓度的增加清除活性而增强，其清除自由基的能力也与寡糖分子量大小密切相关。
六、琼胶
（一）概述
琼胶主要来源于石花菜、鸡毛菜、江蓠等红藻中的杂多糖。琼胶主要由琼胶酯（agaropectin）和琼脂糖（agarose）两种成分组成。琼胶酯又称硫琼胶，为非凝胶部分，是带有硫酸酯（盐）、葡萄糖醛酸和丙酮醛酸的复杂酸性的杂多糖，硫酸基位于α-L-半乳糖的C6上，和琼胶糖相比，琼胶酯在水中更容易溶解。琼脂糖是由3，6-内醚-L-半乳糖和D-半乳糖为成分构成的中性多糖，属于非离子型多糖，以1，4糖苷键连接的α-3，6-内醚-L-半乳糖和1，3糖苷键连接的β-D-半乳糖交替连接起来的形成直链结构（图2-38），能够形成凝胶，所形成的凝胶具有高融化温度、低凝固温度、无色透明及高凝胶强度等特点。
图2-38 琼脂糖的结构
（二）理化性质
1.物理性质检测
在室温下琼胶基本不溶于水和无机、有机溶剂，但可缓慢溶于热水；虽然在冷水中不溶解，但吸水后能够膨胀。当有电解质存在时，在琼胶溶液中加入3～4倍量丙酮、异丙醇或乙醇时，琼胶可脱水成絮状析出；在琼胶溶液中加入近饱和的硫酸铵、硫酸镁或硫酸钠，可盐析析出。
由于琼胶分子的结构、分子量和纯度存在不同，所生成凝胶表现出不同的弹性强度。琼胶的一个重要参数是凝胶强度，一般情况下，1.5%琼胶溶液可凝固成具有弹性且强度高的冻胶。
2.组成和结构的研究
为确定琼胶的化学结构，研究人员开展了大量的研究工作。利用稀酸水解琼胶，有D-半乳糖生成，含量约占40%，说明琼胶主要由半乳聚糖组成。琼胶的组成中除了半乳糖外，还含有硫酸基、甲氧基、丙酮酸等。至今，琼胶主要化学成分和结构已清楚，为其在食品、医药、生物技术等领域的广泛应用奠定了基础。
（三）生理活性
琼胶主要来源于各种红藻中，在医药、卫生及食品等方面有着广泛用途，但由于琼胶水溶性低、黏度高，不易被吸收，使其应用受到极大限制。琼胶寡糖（agaro oligosaccharide，AOS），即琼胶多糖经水解后产生聚合度为2～10的低聚糖（琼胶低聚糖），主要的重复单位为琼胶二糖，易溶于水，有利于人体吸收，使其应用价值大大提高。琼胶低聚糖不仅具有一般功能性低聚糖所具有的特性，而且还有许多寡糖无法替代的生理活性，如较强的抗老化、抗龋齿、抗氧化、抗炎及抗癌等活性，是一种极具开发潜力的低聚糖（王鸿等，2008）。
1.抗菌及抗病毒活性
一定聚合度的琼胶寡糖对腮腺炎病毒、脑膜炎B型及流感病毒均有抑制作用（缪伏荣等，2007）。一种大分子质量琼胶类硫酸半乳低聚糖可选择性地抑制单纯疱疹病毒（Ⅰ型和Ⅱ型），这可能是因为此类寡糖干扰了病毒对宿主细胞的最初附着。琼胶寡糖具有较强的抑菌作用，当浓度为3.11%时，可使菌落的产生有效地减少，所以可作为天然防腐剂。由琼胶二糖等作为主要成分制成的防腐剂，可用于饮料和食品的保鲜，有效防止其色变、腐败及氧化等；对各种食品，包括易变质食品和加工食品，还有留香作用。
2.增殖肠道益生菌作用
琼胶寡糖对肠道菌群生长表现出益生元效应。体外实验发现琼胶寡糖对消化道酶的消化作用有耐受作用，几乎所有的新琼胶寡糖经上消化道酶作用24h后，不受淀粉分解酶的影响，说明它可以完整到达大肠，不能被宿主胃肠道消化或吸收（郭晓凤，2014），同时发现能对培养基上厌氧生长的双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖具有明显促进作用，促增殖作用起效快，大大缩短了益生菌的生长适应期。
3.抗肿瘤和免疫增强作用
不同聚合度的琼胶寡糖，其生理活性具有较明显的差异。在2～4之间聚合度的低聚糖可使肿瘤坏死因子TNF-α和前列腺素PGE2的产生受到抑制，从而对癌细胞表现出抑制作用。琼胶二糖具有抑制膀胱癌、肝癌和胃癌等肿瘤细胞作用。通过酶解法制备得到水溶性琼胶寡糖WSAP3在体外对S180细胞周期无抑制作用，也不能诱导细胞的凋亡；然而体内实验研究中可显著抑制肿瘤，抑制率可达48.7%。琼胶寡糖对血管形成具有明显的抑制作用，且该作用主要是通过促进脐静脉内皮细胞凋亡并阻滞细胞周期于S期产生的。
4.抗氧化作用
多余的自由基会损伤机体，许多疾病，如血栓、动脉粥样硬化、白内障以及老年性痴呆、帕金森综合征、类风湿性关节炎、糖尿病并发症等，都与不能及时清除的自由基有关。体外研究证实，不同聚合度c（DP分别为2，4，6，8，10）对自由基有较好的清除作用。当琼胶寡糖（高、中分子琼胶寡糖混合物）浓度为400mg/kg时，心脏和肝脏内的丙二醛（MDA）活力分别降低了21%和44%，血清中的谷丙转氨酶（ALT）活力降低了22.16%，血清和肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活力都达到了最高水平。生物体内过量的NO起着强氧化作用，会造成基因和细胞的损伤。琼胶寡糖可以使诱导型合成酶iNOS的表达得到抑制而避免NO的过量产生，从而消除过量NO引起的损伤，避免相关疾病的发生。
5.其他活性
以琼胶寡糖作为添加剂的化妆品具有很好的调理头发的作用。新琼胶二糖（低分子质量、中性）具有良好的美白、吸湿的双重功效。通过酶解法制备得到不同聚合度的A、B系列琼胶寡糖，在低、中、高不同湿度环境下，两者表现出一定的保湿作用，并有良好的吸湿性，且糖链聚合度的大小与其吸湿保湿功能密切相关，高聚合度的寡糖吸湿保湿性要弱于低聚合度寡糖，两者对细胞均无明显的毒副作用，是一种很有开发价值的化妆品天然原料。
七、大型绿藻多糖
（一）概述
绿藻是海藻中种类最为丰富的一类，具有很高的经济价值。小球藻、扁藻等可作为饲料、食品或者提取脂肪、蛋白质、核黄素和叶绿素等多种物质。沿海常见的绿藻有浒苔、石莼、礁膜等，历来是沿海人民的食用海藻（图2-39～图2-41）。多糖是绿藻中的主要成分，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血脂、抗凝血、抗病毒等多种生物活性。绿藻中的多糖是很好的药用和食用资源，具有广阔的利用和开发前景。本节主要介绍大型绿藻多糖的研究情况。
图2-39 石莼（Ulva lactuca）的外部形态
图2-40 浒苔（Enteromorpha prolifera）的外部形态
图2-41 礁膜（Monostroma nitidum）的外部形态
（二）绿藻多糖的结构研究
水溶性硫酸多糖是绿藻多糖的主要组分，绿藻中水溶性的硫酸多糖主要位于细胞间质内，当然在细胞壁中亦有少量存在。不同种类的绿藻所含的多糖糖苷键类型、单糖组成及摩尔比例等多方面都会有所差异。即使是同一种属的绿藻，也会随采集时间、采集地点、提取方法等方面的差别而有不同。研究显示，水溶性硫酸多糖一般可分为葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物和木糖-阿拉伯糖-半乳糖聚合物两类（嵇国利，2010）。
1.葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物
葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物主要存在于浒苔、礁膜、石莼、顶管藻等绿藻中，这类聚合物主要是由木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等组成的（房芳，2008），从扁浒苔Enteromorpha compressa中提取得到的杂多糖主要由（1→4）-Xylp，（1→4）GlcA，GlcA（1→（1→2，4）-Rhap和（1→4）-Rhap组成，硫酸基团主要位于1，4-连接木糖的C 2位以及1，4-连接鼠李糖的C3位。从石莼Ulva pertusa中得到的具有免疫活性多糖F2，对多糖F2进行结构分析表明，该多糖主要由β-（1→4）-D-GlcA，α-（1→4）-L-Rhap，β-（1→4）-D-Xyl和β-（1→2）-L-Rhap组成，鼠李糖的O2位处于分支点。硫酸根主要位于葡萄糖醛酸的O3位。礁膜Monostroma latissimum多糖主要由1，2-和1，3-连接的鼠李糖组成，硫酸根主要位于1，2-连接的鼠李糖C4或C3位。
2.木糖-阿拉伯糖-半乳糖聚合物
木糖-阿拉伯糖-半乳糖聚合物主要存在于松藻、蕨藻、刚毛藻等绿藻中，这类聚合物的主要单糖是半乳糖和阿拉伯糖，并且硫酸化程度相对较高（张会娟，2007）。从蕨藻Caulerpa racemosa中提取制备得到酸性杂多糖，该多糖具有分支，主要由1，3-半乳糖，1，4-木糖，1，3，4-和1，4-阿拉伯糖组成，硫酸根位于1，3-连接半乳糖的C6位和1，4-阿拉伯糖的C3位（Chosh等，2004）。松藻Codium yezoense中的水提多糖主要有D-半乳糖、丙酮酸和硫酸基，三者的摩尔比为4∶1∶2。该多糖的线性主链为→3）-β-D-Galp-（1→，其中主链中大约有40%在C6位有分支，分支主要是1，3-和1，6-连接的半乳糖，也可能有些是寡糖残基。硫酸基团的多数位于C4位，少量是位于C6位；丙酮酸位于非还原末端半乳糖残基的O3和O4位，形成五元环酮（Bilan等，2007）。
（三）绿藻多糖生物活性研究
水溶性硫酸多糖是绿藻中主要的多糖，大量研究表明，这些水溶性的硫酸多糖具有多种生物学作用，主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、降血脂、抗病毒、防辐射、抗氧化等（林聪，2014）。
1.抗凝血活性
多种绿藻多糖表现出抗凝血活性。常见的石莼属、松藻属、礁膜属多糖均具有良好的抗凝血活性。从刺松藻Codium fragile（来源于韩国济州岛）中提取得到的多糖分子量均大约3万，可使APTT时间显著延长。Hayakawa等（2000）从8种绿藻中提取得到8种多糖，这8种多糖均表现出显著的抗凝血作用，它们可通过依赖肝素的辅助因子Ⅱ途径实现对凝血酶的抑制，其抑制作用要强于硫酸皮肤素和肝素。Matsubara等（2001）从Codium cylindricum中提取到一种高度硫酸化的半乳聚糖，其抗凝血活性与肝素类似但比肝素稍低。
2.免疫调节活性
研究显示多种绿藻多糖具有免疫调节作用。体外实验表明，浒苔硫酸多糖能够在不改变IL-5和IL-4分泌的情况下，显著增多IL-2和FN-γI的分泌物，促进Con-A诱导的脾细胞增殖，促进信使RNA表达产生多种细胞因子，使巨噬细胞激活合成NO。采用冷水法从刺松藻中提取得到的硫酸多糖能与多种细胞活素协同作用，使机体免疫能力得到增强（齐晓辉，2012）。
3.抗病毒活性
现已发现绿藻硫酸多糖对多种病毒具有抑制作用。Cassolato等（2008）从石莼属Gayralia oxysperma中提取的3种水溶性硫酸鼠李杂聚糖多糖，均表现出很强的抑制单纯疱疹病毒作用，且抗HSV-1和HSV-2活性要比肝素强。3种多糖表现出的强抗病毒活性与它们的结构特征密切相关，即硫酸根含量、分子量以及存在于鼠李糖的C5位的疏水性甲基基团。Chosh等（2004）采用热水法从Caulerpa racemosa中提取的多糖HWE可有效抑制两种类型的疱疹病毒HSV1和HSV2，该多糖在接近IC50值时并未表现出抗凝作用。礁膜Monostroma nitidum中的硫酸鼠李聚糖表现较强的抗HSV2作用，抗病毒机制主要与使病毒对宿主细胞的吸附和入侵受到抑制有关（Lee等，2010）。
4.降血脂活性
一些绿藻中含有的硫酸化多糖可降低血浆中胆固醇的含量。研究显示，石莼多糖可使外源性高脂血症小鼠的甘油三酯和胆固醇明显降低。采用热水提取法从石莼Ulva pertusa中得到的粗多糖，将粗多糖降解，获得了两个低分子量多糖组分。对粗多糖及两个低分子量多糖组分进行抗高血脂活性实验，结果显示这3种多糖可明显降低血清中低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇的含量（Yu等，2003）。
5.抗氧化活性
绿藻多糖是一类天然抗氧化剂，对活性氧自由基有显著的清除作用。Li等（2013）从浒苔Enteromorpha prolifera中采用用热水提取法提取多糖，并通过微波辅助酸水解法获得具有不同分子量的多糖，所有多糖样品在低浓度时即可显著清除超氧化物自由基，且低分子量多糖的抑制作用要弱于高分子量多糖；低分子量多糖可更显著地抑制羟基自由基；在浓度为5mg/ml时分子量为3100的多糖组分离子螯合的能力为77.3%，显著高于未降解多糖。Wang等（2013）研究显示，浒苔Enteromorpha linza多糖对DPPH自由基和超氧化物自由基有显著清除作用，并且那些具有合适分子量大小和硫酸根含量较高的多糖表现出更强的抗氧化作用。Tang等（2013）报道浒苔多糖EPF2不仅降低高脂血症小鼠体内脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量，而且可提高内源性抗氧化酶的活性。
6.抗肿瘤活性
绿藻中的一些硫酸化多糖表现出明显的抗肿瘤作用（Sheng等，2007），多糖组分CPPS Ia和CPPS IIa是从小球藻中分离纯化得到的，两种多糖组分均能显著抑制肿瘤细胞A549的增殖，且表现出剂量依赖性。CPPS Ia和CPPS IIa在浓度为1000μg/ml时，对细胞A549的抑制率分别为68.7%和49.5%。Ji等（2008）以Caulerpa racemosa为原料，采用中性蛋白酶和热水联合提取法提取得到粗多糖CRP，将其进一步纯化得到两种多糖组分：CRPF1和CRPF2，粗多糖CRP在较低剂量（0.05～0.20mg/ml）时对K562细胞的抑制作用要强于纯化组分CRPF1和CRPF2，而且发挥更长的作用时间（72h）。Jiao等（2009）采用碱提取法从肠浒苔Enteromorpha intestinalis提取得到的多糖表现出显著的抗肿瘤活性，推测与其具有较强的免疫刺激活性有关。
可以看出，绿藻多糖具有多种生物活性，且毒副作用较低，在医药、功能食品等多个领域具有广阔的开发前景。
