5.3.3 产甲烷过程的稳定碳同位素分馏效应
1.不同反应器中气相稳定碳同位素比值
图5-4显示了不同反应器气相δ13CH4和δ13CO2值的变化。可知，采用不同接种污泥的体系中，稳定碳同位素的分馏效应具有一定的差异。
低氨浓度 10 mmol/L TAN下，各反应器δ13CH4和δ13CO2值的变化趋势相似，即：TCS-N0.14（1）中，δ13CH4由活跃产甲烷期的-54.0‰升高到稳定期的-41.6‰，稳定期后期又略有降低（-44.4‰）；相应的，δ13CO2由活跃期的-19.9‰升高到稳定期的-14.3‰，稳定期后期为-14.8‰。MCS-N0.14（1）中第5 d已处于活跃产甲烷末期，其δ13CH4已经达到-47.6‰，稳定期后期δ13CH4降低至-52.8‰～-53.4‰，δ13CO2则由-17.2‰升高到-12.2‰。MFS-N0.14（1）中δ13CH4的变化规律与TCS-N0.14（1）相似。
图5-4 不同氨浓度各反应器的δ13CH4和δ13CO2
由于产甲烷反应中存在同位素分馏效应，乙酸中的12C被优先转化，进而引起了残留乙酸中13C的富集。进入产甲烷稳定期后，溶液中的乙酸已经大部分被消耗，而13C富集效应使得低浓度残留乙酸中13C含量增加，这有可能导致了稳定期δ13CH4和δ13CO2值同时增加[67]。而在稳定期末，乙酸已基本被消耗完毕。当乙酸处于限制状态时，产甲烷菌可能开始利用H2和CO2作为基质进行氢营养型产甲烷途径，从而使得δ13CH4值降低，δ13CO2值增加。
较高氨浓度 214～357 mmol/L TAN下，各高温反应器在稳定期显示了更强烈的13C富集效应，δ13CH4由活跃期初始（10 d）的-64.7‰～-64.5‰，逐渐升高到稳定期的-11.7‰～-28.4‰（46 d）；而δ13CO2则经历了先降低（由-8.9‰～-11.6‰降低到-18.8‰～-19.5‰），后增加（增加到-13.8‰～-14.1‰）的过程。214 mmol/L TAN下，MCS-N3和MFS-N3中活跃期的δ13CH4分别稳定于-49.9±0.8‰和-54.3±1.0‰，δ13CO2则分别为-13.7±1.0‰和-14.4±2.5‰。随着乙酸逐渐被消耗，MCS-N3中的δ13CH4呈现缓慢降低的趋势，而MFS-N3中的δ13CH4则于活跃末期（46 d），增加到-44.3‰。
临界氨浓度 处于不稳定状态下的TCS-N7（2）、MCS-N5和MFSN5反应器中，δ13CH4和δ13CO2在后活跃期的值分别低于和高于前活跃期的值。如在MFS-N5中，δ13CH4和δ13CO2在前活跃期分别稳定于-56.0‰～-61.2‰和-8.1‰～-16.4‰，进入后活跃期时则分别降低和升高至-94.0‰和-7.8‰。TCS-N7（2）和MCS-N5在由前活跃期向后活跃期的过渡中，δ13CH4和δ13CO2亦分别呈现逐渐减少和增加的趋势。
高氨浓度 甲烷化启动前，反应器TCS-N7（1）、TCS-N9、MCS-N7和MFS-N7均经历了较长的迟滞期。在这些反应器内，除MFS-N7外，δ13CH4值均处于较低水平，而δ13CO2的值则处于较高水平。TCS-N7（1）中，δ13CH4的值由活跃产甲烷初期的-59.0‰～-63.8‰降低至后期的-70.4‰，δ13CO2则由-11.9‰～-18.0‰增加至后期的-2.1‰。TCS-N9和MCS-N7中，甲烷快速产生时，δ13CH4的值始终低于-70.0‰，而δ13CO2的值始终高于-10.0‰。在MFS-N7中，活跃产甲烷初期，δ13CH4值较低（-63.3‰～-74.6‰），δ13CO2较高（-4.6‰～-11.3‰），而在活跃期中后阶段，δ13CH4则显著增加（-18.4‰～-41.9‰），δ13CO2则相应减少（-14.6‰～-14.1‰）。
对于未进入活跃产甲烷期的MCS-N9和MFS-N9，δ13CH4值始终低于-84.0‰，而δ13CO2值则高于-6.1‰。
2.不同反应器中的表观产甲烷同位素分馏因子αc(https://www.daowen.com)
各反应器气相αc值的计算结果见图5-5。可知，不同反应体系中均呈现出αc值随氨浓度增加而提高的趋势，但其随时间的变化过程却存在一定的差异。
图5-5 不同氨浓度各反应器的αc值
低氨浓度 10 mmol/L TAN下，各反应器的αc值均处于较低水平，为1.022～1.049。活跃产甲烷期初始阶段，αc值较高。随着甲烷的快速产生，αc值降低。活跃产甲烷末期和稳定期，αc值又有升高的趋势。Whiticar等人研究发现[200]，αc＞1.065时，氢营养型途径为产甲烷主导途径；αc＜1.055时，甲烷则主要通过乙酸发酵型途径产生。由此分析，低氨浓度下，甲烷化代谢主要通过乙酸发酵型途径进行生成，其同位素分离效应随着乙酸的逐渐消耗而有所变化。13C在液相基质中的富集，可能导致了培养后期αc值的降低。
较高氨浓度 214～357 mmol/L TAN下，高温反应器进入活跃产甲烷期后，αc值呈现逐渐降低的趋势，由缓慢产甲烷末期的1.058～1.060，逐渐降低到活跃产甲烷后期的0.996～1.015；357 mmol/L TAN下的αc值则略高于214 mmol/L TAN时。214 mmol/L TAN下，处于活跃产甲烷期的MCS-N3和MFS-N3中，αc值略有差异。MCS-N3中αc值稳定于1.038，当产甲烷速率开始降低时，αc值开始有升高的趋势；MFS-N3中αc值则呈现缓慢降低的趋势，由初始的1.047逐渐降低到1.032。
由此可见，在较高氨浓度下（高温214～357 mmol/L TAN，中温214 mmol/L TAN），甲烷主要由乙酸直接发酵产生。随着乙酸的逐渐转化，厌氧生境中的基质浓度、pH等也在变化。不同的微生物体系中，αc值随时间的变化开始出现细微的差异。
临界氨浓度 随着氨浓度的提高，氨对微生物的胁迫也逐渐增加，达到临界浓度时，微生物体系开始变得不稳定。500 mmol/L TAN下，TCS-N7（2）几乎同时与TCS-N5（1，2）进入活跃产甲烷期，其αc值在初始阶段由1.054缓慢降低至1.036，进入后活跃期时则又呈现出升高的趋势（升高到1.041）。MCS-N5中，αc值由前活跃期的1.047逐渐增加到后活跃期的1.063。MFS-N5中，αc值在0～40 d时于1.046～1.051间小幅度波动，培养后期产甲烷速率开始再次增加时，快速升高到1.096。
可见，在不稳定状态下，产甲烷过程的初始阶段，甲烷主要通过乙酸发酵型途径生成；而在此后的中间抑制期和后活跃产甲烷期，氢营养型途径的贡献逐渐增加，并成为主导途径。由此推测，乙酸营养型产甲烷菌对于氨胁迫具有一定的抵抗力。随着乙酸的消耗，pH升高，导致氨的存在形态改变，胁迫增强，产甲烷菌即开始受到抑制，产甲烷过程进入中间抑制期。随着胁迫环境下暴露时间的增加，产甲烷菌受到驯化，或者新的具有胁迫耐受性的产甲烷菌群逐渐产生并成为优势菌群，乙酸的代谢途径随之发生变化，产甲烷过程进入后活跃产甲烷期。
高氨浓度 TCS-N7（1）、TCS-N9和MCS-N7、MFS-N7反应器均经历了长达30～60 d的产甲烷迟滞期。甲烷化启动后，TCS-N7（1）中的αc值由缓慢产甲烷期的1.044～1.055逐渐增加到活跃产甲烷期的1.073。TCS-N9中，αc值由缓慢期的1.080逐渐增加至活跃期的1.095。类似的，MCS-N7中，αc值由1.076（±0.002）逐渐增加至1.100。MFS-N7则与其他反应器不同，即：αc在缓慢期具有更高的值（1.043～1.075），进入活跃期后，反而快速降低（1.003～1.038）。由此推断，活跃产甲烷期，在TCS-N7（1）、TCS-N9和MCS-N7中，甲烷主要由氢营养型途径生成；而在MFS-N7中，甲烷则主要通过乙酸发酵型途径产生。
643 mmol/L TAN下，在未进入活跃产甲烷期的MCS-N9和MFS-N9中，CH4和CO2在培养末期缓慢产生，此时αc的值处于较高水平（1.088～1.096），产甲烷反应具有极强的碳同位素分馏效应。