四、抗体技术
抗体技术是重要的免疫学技术，其在生命科学研究、抗体药物研发等领域具有重要的作用。随着生命科学等相关学科的发展，抗体技术主要经历了多克隆抗体、单克隆抗体以及基因工程抗体3个发展阶段。
（一）多克隆抗体
用一种包含多种抗原表位的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，该混合物称为多克隆抗体（图7-4）。由于多克隆抗体的制备过程中并没有将这些混合抗体分开，因此由抗原免疫动物后制备获得的抗血清中包含有针对这一抗原的各种各样的抗体。多克隆抗体制备时间短、成本低廉，同时能够识别更多的抗原表位，故其通常比单克隆抗体具有更高的亲和性，但由于多克隆抗体的特异性相对较差，易出现交叉反应，限制了在免疫化学试验以及疾病诊断和治疗中的应用。
图7-4 多克隆抗体制备流程示意图
（二）单克隆抗体
1975年，Kohler和Milstein成功把免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成了B淋巴细胞-骨髓瘤细胞杂合体，这种杂合体既能在体外培养中无限地快速增殖且存活，又能分泌单克隆抗体，并由此建立了单克隆抗体技术（monoclonal antibody，MoAb）。这是抗体产生的重大技术革命，两位发明者于1984年被授予诺贝尔医学奖与生理学奖。
这种由单一B淋巴细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将免疫B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，得到的杂交瘤细胞具有双亲细胞的遗传特性，既能像B淋巴细胞一样分泌抗体，又能像骨髓瘤细胞一样无限增殖，成功克服了B淋巴细胞在体外存活周期短的问题，对杂交瘤细胞进行培养，即可得到单克隆抗体（图7-5）。
图7-5 单克隆抗体制备流程示意图
单克隆抗体具有特异性强、效价高、性质均一、少或无血清交叉反应、易于大量生产、成本低等优点，制备鼠源性单抗是单克隆抗体技术的最初技术，也是发展至今非常成熟的技术。然而，单克隆抗体技术自问世以来，在临床治疗方面进展缓慢，主要是由于迄今为止所获得的单克隆抗体多为鼠源性，其异源性的本质会引起人体免疫系统针对异种蛋白的免疫反应，临床应用易产生抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA），甚至产生超敏反应，影响临床效果。因此，在保持对特异抗原表位的高亲和力的基础上进行人源化和全人化的改造，减少异源抗体的免疫原性成为单克隆抗体研究的重点。
（三）基因工程抗体
随着分子生物学技术的发展，研究者开始尝试利用基因工程手段来改造鼠源性单克隆抗体，此时，抗体技术发展到第三个阶段——基因工程抗体阶段。采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生的新型抗体，称为基因工程抗体。基因工程抗体技术对已有的单克隆抗体进行改造，包括单克隆抗体的人源化（嵌合抗体、人源化抗体）、小分子抗体以及抗体融合蛋白的制备等，可有效解决传统杂交瘤技术所存在的问题，为单克隆抗体的应用提供更广阔的空间。
1．基因工程抗体的优点 基因工程抗体具有如下优点：①通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；②基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；③根据治疗的需要，制备新型抗体；④可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。
2．基因工程抗体的主要类型 基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体等。
（1）嵌合抗体（chimeric antibody） 属第一代人源化抗体，有60%～70%的人源区域，是目前研究较多也较为成熟的基因工程抗体。实质是在同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体。目前构建的嵌合抗体多为人-鼠嵌合抗体类型，它是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子，其中抗体的Fc片段来源于人类，而Fab来源于鼠类（图7-6）。人-鼠嵌合抗体的人源化程度可达到70%，完整地保留了鼠源单抗的可变区，最大限度地保留了亲本活性，人抗体恒定区的引入则大大降低了免疫原性，延长了抗体在体内的半衰期，改善了抗体药物动力学。嵌合抗体虽然可以部分解决异种蛋白的排斥问题，但由于其还含有鼠源V 区，依然有可能会诱发HAMA 反应，干扰抗体疗效，诱发超敏反应，在临床上其应用会受到一定限制。
图7-6 人鼠嵌合抗体制备流程示意图
（2）人源化抗体（humanized antibody） 指利用基因工程重组技术，对抗体基因进行重组，将人抗体的CDR代之以鼠源性单克隆抗体的CDR，抗体的恒定区部分（即CH 和CL区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码的抗体。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫不良反应。抗体人源化已成为将鼠源抗体转化为有效安全的治疗药物的重要方式，人源抗体药物开发也成为各大药企争相研发的热点。但是人源化抗体是否可以完全解决鼠抗体临床应用中的所在问题，还有待大量临床试验的检验。目前，抗体人源化方法还在不断发展和完善，目标是提高抗体亲和力，降低抗体异源性，同时兼顾抗体的免疫学活化作用。相信随着技术的发展，人源化抗体将会在相关疾病的临床诊断和治疗中发挥更巨大的作用。
（3）单链抗体（single chain antibody fragment，scFv） 通过人工合成的连接肽（Linker）基因将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）连接成重组基因，由该重组基因表达的抗体（图7-7）。Linker的作用是连接VH、VL，并保持一定的弹性，使VH、VL的功能区折叠后仍可配对，构成单价抗原结合位点。scFv相对分子量约为25000，仅为完整抗体的1／6。scFv具有分子质量小、穿透力将强、特异性较高等优点，在靶向治疗、细胞免疫等方面有着重要的应用。在靶向治疗方面，可以将药物和毒素与scFv链接，形成免疫药物或者免疫毒素等，利用抗原与抗体特异性结合的特点，定位于靶细胞，对靶细胞进行特异性免疫杀伤；在细胞免疫方面，病毒感染生物体后，细胞内表达能识别某种病毒编码蛋白的抗体，从而阻止病毒在细胞间传递，抗病毒蛋白的单链抗体可以在细胞内克隆与表达，从而可用于病毒感染性疾病的诊断和治疗。随着对scFv研究的不断深入，scFv将凭借自身的优势，在医学、食品等领域发挥更巨大的作用。
图7-7 单链抗体制备流程示意图
（4）双特异性抗体（bispecific monoclonal antibody，BsAb） 一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体，所以它可以把免疫细胞、病毒分子等连接到肿瘤细胞上，进而增强对靶细胞的杀伤作用，同时它也可以结合同一肿瘤细胞上的不同抗原以增强其结合特异性，从而减少脱靶毒性等副作用，这种具有双功能的重组抗体作为治疗肿瘤的药物拥有比单抗药物更好的疗效。双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原（如肿瘤细胞）结合，另一条与免疫效应细胞或药物或酶结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀灭肿瘤细胞（图7-8）。通过基因工程方法制备的双特异性抗体具有分子量小、制备过程简单、制备成本低以及可批量制备等优点。可应用于免疫检测和免疫治疗。目前国内对于双特异性抗体的相关研究正处于萌芽阶段，但是凭借其在抗肿瘤治疗中的巨大潜力，相信在该领域我国将拥有巨大的发展空间，未来可以利用更多更好的策略来优化各种双特异性抗体药物，使其具有更强大的疗效和更小的副作用，为肿瘤患者带去福音。
图7-8 BsAb介导效应细胞、酶和药物对肿瘤细胞的作用