抗体工程研究现状
抗体工程是指利用重组DNA 和蛋白质工程技术，对抗体基因进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞后，表达抗体分子，或用细胞融合、化学修饰等方法改造抗体分子。目前抗体工程研究主要集中在抗体人源化、抗体改造、抗体的高效表达系统、抗体的应用等几个方面。
（一）抗体人源化
早期的抗血清治疗，由于其成分复杂且是异源蛋白，治疗时易出现严重副作用，影响治疗效果。20世纪80年代，克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）发明了淋巴细胞杂交瘤技术，终于使制备纯一抗体的难题获得了解决。基于该技术获得的单克隆抗体是一种均一性好、可无限生产的、抗单一抗原表位的抗体。1986年，美国FDA批准抗CD3单抗0KT3用于抗移植排斥反应，1995年，欧洲上市17-1A 鼠单抗治疗大肠癌，在临床上取得较好疗效，但是，这些单抗的临床应用显示出两个方面的主要问题：鼠抗体虽然对靶抗原是特异的，但它不能激活相应的人体的效应系统，如补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等；此外，鼠抗体作为异源蛋白，进入人体会使人体免疫系统产生应答，诱导超敏反应或中和鼠抗体，即产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）反应，影响疗效；此外，异源蛋白在人体内更易被清除，作用时间段也影响鼠源抗体的疗效。因此，如何解决鼠源抗体带来的不足，成为当时研究的一个焦点和关键问题。随着DNA重组技术的发展，利用基因重组技术实现抗体人源化很好地解决了这个问题。
抗体人源化的基本原则 抗体人源化的基本原则是：保持或者提高抗体的亲和力和特异性，显著降低或基本消除抗体的免疫原性。主要实现途径有人-鼠嵌合抗体、人源化抗体和人源抗体。
（1）人鼠-嵌合抗体 是将鼠抗体可变区基因片段连接到人抗体恒定区基因，然后表达出一个完整的抗体分子，抗体分子里面一部分是来自鼠源的序列，一部分是来自人源的序列，由于IgG稳定容易保存，故嵌合抗体通常用IgG 型。一般嵌合抗体的人源化程度可达70%，与鼠源抗体相比，嵌合抗体很大程度上减少了鼠源序列的比例，但是由于它仍保留着大约30%的鼠源序列，有时还是会引起不同程度的HAMA反应。因此在临床应用中，需要对其进行进一步的人源化改造，获得人源化程度更高的抗体。
（2）人源化抗体 是利用基因重组技术将鼠源基因更小的区域或基因片段插入到人抗体基因分子中，替代人抗体基因分子中对应部位，进而表达的抗体。将鼠源抗体的互补决定区（complementarity determining region，CDR）移植到人抗体的相应部位，可以使得抗体分子人源化高达90%以上，这是非常有效的一种人源化方法，这种抗体称为改型抗体。
1988年Riechmann L．等首次成功构建并表达出与CDw52特异性结合的改型抗体。此后，改型抗体经历了两个主要的发展阶段：即最初简单的CDR 移植以及随后多种策略的CDR移植。简单的CDR移植是将鼠源抗体的6个CDR通过PCR技术移植到人抗体相应的骨架区（framework region，FR）上构建成新抗体。但由于FR区影响CDR的空间构型，可能改变单抗原有的CDR构型，从而造成抗体结合抗原的能力会下降甚至消失。虽然已能对抗体进行分子设计，但有时还是会出现人源化抗体无法达到原母本鼠源单抗相近的亲和力。
随着计算机辅助分子模拟技术的发展蛋白质结构、抗原抗体复合物结构的精确解析以及分于对接技术的不断完善，改型抗体进入了第二代，其策略包括：①部分CDR 移植；②表面重塑，即对鼠源CDR与FR表面残基进行镇嵌／重塑，使之类似于人抗体CDR的轮廓；③特定决定区（special determining region，SDR）移植，将抗体中与抗原密切作用的关键氨基酸形成的SDR移植到人抗体相应的位置。此外，通过CDR补偿、定位保留、模板替换等策略也在一定程度上保证人源化抗体能够保持母本鼠源抗体的亲和力。人源化抗体相对人-鼠嵌合抗体更接近人体抗体的结构，很大程度上降低了对人体的免疫原性，但是其仍至少有5%～10%的异源性。在治疗过程中仍然存在可能的潜在风险。如何获得跟人体抗体基本一致的抗体即人源抗体至关重要，人源抗体才是治疗性抗体的发展趋势。
（3）人源抗体 人源抗体是跟人体抗体结构基本一致的抗体，是治疗性抗体的发展趋势。目前人源抗体的制备主要有4种技术：人-人杂交瘤技术、EB病毒转化人B淋巴细胞、抗体库技术和转基因动物。目前常用抗体库技术和转基因小鼠技术来制备人源抗体。
抗体库技术包括噬菌体抗体库（图7-9）、合成抗体库和核糖体展示抗体库等。随着基因敲除技术的成熟，人们可以将小鼠免疫球蛋白基因组敲出，将人免疫球蛋白基因组敲入。这样的转人免疫球蛋白基因小鼠只含有人源抗体基因，用抗原免疫后，可直接从免疫动物的血清中纯化特异性人源抗体，或获得足够数量对抗原特异的B细胞，利用单克隆技术制备单克隆抗体或进一步利用噬菌体抗体库技术制备出高亲和力的基因工程全人抗体。
图7-9 人源抗体库示意图
随着结构生物学、计算生物学生物信息学、计算机科学的迅速发展，借助已有的抗原／抗体基因序列、结构信息以及抗原-抗体相互作用模式分析，合理确定功能抗体识别的靶位（即抗体药物识别的抗原表位），使得人源抗体的从头设计成为可能。该方法（图7-10）回避了杂交瘤技术、抗体人源化技术、抗体库技术等的专利限制，有着非常好的应用前景。
（二）抗体改造
抗体虽然是一个天然分子，但作为治疗用药物必须满足生物制剂的各项要求，如亲和力、特异性、稳定性、溶解度、聚合度、表达水平和功能等。因此，得到一个抗体基因，并不是表达后就能成为药物，必须要对其进行改造，使其符合上述要求。此外，也要根据抗体的作用机制进行改造，使之符合临床的需要。
治疗性抗体的作用机制主要可归为两类：一类是依赖于它们的抗原结合功能，例如抗体与抗原结合后阻断或中和靶分子的生物学活性，利用抗体的靶向性将细胞毒性物质导向到靶部位抗体与细胞膜抗原结合后诱发信号传导的改变引起细胞凋亡等；另一类与抗体的Fc结构有关，如激发ADCC和CDC效应达到杀伤靶细胞的目的因此改进抗体与FcγR结合或与补体的结合，可以提高抗体的治疗效果。
图7-10 人源抗体从头设计的基本流程
①深入分析抗原及功能表位空间构象、理化特征；②收集人源抗体可变区序列信息，构建人源抗体可变区FR序列及构象数据库；③利用计算机辅助分子设计方法设计针对功能表位的拮抗肽；④考察FR、CDR匹配特征，通过合理组合设计获得人源抗体；⑤抗体的功能评价。(https://www.daowen.com)
针对上述作用机制，对治疗性抗体进行改造。改造途径有改变抗体分子大小、提高抗体亲和力、改进抗体的ADCC或CDC效应、改变抗体的药代动力学、引入新的效应功能、构建双特异性抗体、构建抗体-细胞因子融合蛋白等。
（三）抗体的高效表达系统
基因工程抗体的表达系统主要有原核表达系统和真核表达系统。原核系统由于不能进行糖基化等翻译后修饰，而且表达产物大多是包涵体，复性困难，得率低，抗体活性也可能受影响等原因仅用于抗体片段的表达。
完整抗体分子的表达需要用真核系统，该系统包括酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞系统。前三种系统由于其糖基化方式和类型与人类不同，一般不用于临床治疗性抗体的表达生产；而哺乳动物细胞表达系统能正确组装成多亚基蛋白，表达的抗体与天然抗体的结构、糖基化类型和方式几乎相同，且经驯化的哺乳动物细胞能以悬浮培养方式，在无血清培养基中高密度、大规模培养。因此，治疗性抗体主要采用哺乳动物细胞表达系统。
与原核系统相比，哺乳动物细胞表达系统的缺点是表达量低、生产成本高。为了提高表达量，人们试图从表达载体筛选、宿主细胞遗传改造和培养工艺优化等多方面进行研究，以获得较好的产率。这些方面也成为当前抗体研究的一个热点问题。
（四）抗体的应用
由于抗体尤其是单克隆抗体特异性强、灵敏度高、理化性质稳定、能大量生产，在实验检测、医学预防与临床治疗各个领域中的应用十分广泛，在医学领域主要用于：①作为医学检验试剂，用于病原微生物、肿瘤抗原、细胞及其亚群等的检测，以及激素或细胞因子等微量物质的测定；②用于蛋白质的纯化，由于单克隆抗体能与相应抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分，将抗体固定在层析柱上，通过亲和层析即可从复杂的混合物中分离、纯化这一特定成分；③作为研究工作中的探针，如用荧光物质或酶标记单克隆抗体作为探针，可方便地确定与其结合的相应分子在细胞中的定位和分布等；④作为疾病的诊断或治疗药物，如肿瘤的导向治疗和放射免疫显像等。随着科技的进一步发展，抗体工程在疾病预防、治疗等方面发挥着越来越大的作用，抗体工程技术及抗体药物发展的面临巨大的市场和潜力。
1．各类抗体的应用特点 由于特点不一样，多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体的应用范围不一样。目前在医学领域应用较多的为单克隆抗体和基因工程抗体，在检测方面也会应用多克隆抗体。
（1）多克隆抗体 是通过抗原免疫动物后由免疫系统产生并分泌到血液中的各种抗体的混合物。抗原的获得有多种途径，传统方法是从不同样品中提取获得，随着基因工程的发展，抗原也可以利用基因工程技术获得。如通过PCR方法扩增获得特定蛋白的基因片段，经双酶切和测序分析后，连接到不同的原核表达载体中，构建重组质粒，转化到大肠杆菌中，诱导表达目的产物，获得纯化融合蛋白作为抗原。由于抗原刺激免疫动物获得的多克隆抗体是多个抗体混杂在一起，因此能够识别更多的抗原表位，故其通常比单克隆抗体具有更高的亲和性，能快速和样品中的抗原结合，所以，常用于开发快速诊断试剂。此外，研究表明针对一些病原菌的特定组分，经过一定方法处理后免疫小鼠，制备的特异性多抗能很好地识别该菌，并在体外对该菌的生长有较好的抑制作用，这为病原生物感染的诊断与治疗提供新的途径。可以预见，在不久的将来将会有越来越多的多克隆抗体应用于监测、诊断和治疗。但由于多克隆抗体的特异性较差，容易发生交叉反应，在一定程度上局限了它的应用。
（2）单克隆抗体 因具有特异性强、效价高、性质均一、少或无血清交叉反应、易于大量生产、成本低等优点，引起广泛关注，近年来发展迅速，并广泛应用于医学、生物学、免疫学等多种学科。最早制备的单克隆抗体是鼠源性单克隆抗体，其在应用上相对多克隆抗体取得了很大成功。其中，单克隆抗体在癌症等疾病的病变诊断中具有重要作用，因其灵敏度高，可以在前期就检测到病变的发生情况，能更早地发现病情，实施早期治疗，不管从经济上，还是患者的治疗效果上，都是非常大的突破。
在药物开发方面，单克隆抗体可以与药物结合形成靶向药物，这已经在肿瘤治疗中得到很好的应用。单抗药物一般分为：治疗疾病（尤其是肿瘤）的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如：最早被美国FDA批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗。抗肿瘤单抗偶联物或称免疫偶联物（immunoconjugate）由单抗与有治疗作用的物质（如：放射性核素、毒素和药物等）两部分构成，其中包括放射免疫偶联物、免疫毒素、化学免疫偶联物，此外还有酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物等。化学药物与单抗相结合的偶联物，作用于病变区域，不但提高药物的疗效，而且还能降低药物对各脏器组织的细胞毒性。单抗与放射性同位素的偶联物，即放射免疫偶联物，其与化学药物连接在一起，起一种双“弹头”的靶向作用，从而增强对肿瘤细胞的杀伤效应、提高对肿瘤细胞的细胞毒性。毒素与单抗的偶联物，免疫毒素来源于植物或细胞毒素由于有强烈的毒性很难作为治疗剂使用，但毒素与单抗的偶联物可在动物模型中显示疗效。
单抗由于具有诸多优点，在疾病的治疗中发挥了重要的作用。在恶性肿瘤治疗方面，无论是单抗为主，还是单抗偶联放射性物质、化疗药物等的免疫治疗，都取得了较好的效果。在其他疾病（如过敏性疾病、感染性疾病、炎症性疾病、器官移植、自身免疫性疾病等）以及一些临床上疑难病的治疗上也取得了新的进展，使疾病的治疗有了更广的选择性，不再局限于原有药物的治疗，特别是人源化程度较好的抗体的使用，已大大减少了异源性反应。
随着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究，利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能，进而开发了新的抗体应用领域，使单克隆抗体技术又向前发展了一步。
（3）基因工程抗体 是按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构，从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。随着基因工程技术的进步，基因工程抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其他分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒，其临床应用的价值越来越大。
随着抗体研究的深入，很多企业开展了以抗体为基础的药物设计与研发，并取得很好的成效，已经有一些抗体药物在临床上得到应用，还有大量研发中的抗体药物慢慢由实验阶段进入到临床应用阶段。目前，在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。此外，抗体疗法在抗病毒感染中发挥重要作用，有助于预防和缓解病毒疾病。新兴的双特异性单抗针对多个病毒靶点，克服了病毒逃逸问题，具有更高效的治疗作用。2014年利用基因工程抗体成功救治2名埃博拉病毒病感染者是基因工程抗体治疗病毒感染的典型案例，也激发了更多研究者、企业关注并开展基因工程抗体药物的研究。
进入20世纪90年代，组合化学技术与基因工程抗体技术相互结合产生了抗体库技术，此技术目前大范围应用与抗体药物研究，从此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。所谓抗体库技术，就是用基因克隆技术克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，然后重组到特定的原核表达载体中，再转化大肠杆菌以表达有功能的抗体分子片段，并通过亲和筛选获得特异性抗体可变区基因。利用抗体库技术筛选到的抗体基因将被用于构建和表达基因工程抗体，获得特点的抗体药物等产品。目前，使用抗体库技术不仅可以筛选特异抗体片段，而且还能够对已有的抗体分子进行改造，如降低抗体鼠源性、提高其亲和力和稳定性等。后者又被称为抗体定向进化，而所使用的抗体库被称为定向进化抗体库。
2．抗体药物的研发和应用现状 目前全球从事抗体药物方面研究的企业有260家左右，研究中的产品达700多个，其中进入临床阶段的约100个。抗体药物是一种由抗体物质组成的药物。从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2017年底，FDA 累计批准70款抗体新药、8款抗体类似药，仅抗体药物平均每年上市2．5个抗体药物，从2014年开始，抗体新药批准数量呈爆发式增长，2014年上市了6个抗体药物，2015年上市了9个抗体药物，2016年上市了7个抗体药物，2017年上市了10个抗体药物，4年时间共批准32款抗体新药，接近此前28年FDA批准的抗体新药数量。
在我国，抗体药物研究被列入“863”计划和国家重点攻关计划，但目前主要是在体外诊断试剂方面的应用较多，产品还是鼠源型或人鼠嵌合型，鼠抗体的人源化改造在生产中仍需要进一步加强与提升。人源性抗体还处于研究的起步阶段，单抗细胞株也分散于各个单位，没能集中形成产业，因此，大力发展抗体工程，使抗体工程迈向产业化已成为生物医学领域的迫切要求。