纤维素酶的作用。

5.纤维素酶的作用。

1）提取、分离和纯化

目前生产纤维素酶的国家有美国、日本、西德、荷兰等。日本过去多用固体曲生产，近年来不少改为深层培养。美国是用深层培养。酶液提取后，通过透析硫酸铵沉淀，或有机溶剂沉淀（丙酮、酒精和2-丙醇等）。再通过分子筛Sephardex凝胶，DEAE-Sephadex离子交换树脂和不同型号的纤维素，电泳，可将不同的酶组分分开，或与其他蛋白分开。近十多年来，由于这些新技术的应用，使我们对纤维素酶本身有更进一步的了解。部分酶已获结晶，但目前的结晶还不纯，除含有纤维素酶外，还含有淀粉酶、聚木糖酶等杂质。迄今，还没有人获得无其他酶杂质的纯纤维素酶结晶。

纤维素酶各组分的分离步骤如下：

①先经Sephadex G-75（分子筛），去掉低分子量的cx酶；

②再通过DEAE-Sephadex（阴离子交换树脂），将C1酶分出来；

③最后通过SE-Sephadex（如C-50，是阳离子交换树脂），将Cx和纤维二糖酶分开。

2）组分和作用

纤维素酶是复合酶，20世纪50年代初Reese提出纤维素酶的作用方式：

到20世纪60年代以后，应用分子筛和离子交换树脂等分离技术，分离出不同组分，这些组分如下：

现在认为结晶纤维素经C1酶作用，形成可起反应的纤维素，再经过内间和外端β-1，4-葡糖酶作用，形成葡萄糖和纤维二糖，纤维二糖经β-葡萄糖苷酶作用形成葡萄糖（见图4）。

C1酶作用的本质还不清楚，它使结晶纤维素打开和水化，变为非结晶纤维素，使Cx进一步作用。在绿色木霉和Tramates sanguinea无细胞制剂中含有大量的C1酶，目前对C1酶的测定方法很不统一，有的用浊度法测定，有的是测棉花的分解或张力变化，也有的测其他种种底物的分解，因而种种不同的命名法，如使棉线张力减少的“A”酶，使滤纸崩溃的“滤纸活力”等。Mandels和Reese认为用浊度法测定微晶纤维的浊度变化来代表水合纤维素酶的活力可能最接近C1的性质。

C1酶和Cx酶之间有协同作用。C1酶在柱层析时只有一个峰（含少量Cx酶），但用等电焦点法可分到二个峰，各含少量的Cx酶，所以C1酶中总混有Cx酶，当用镰刀菌的C1酶单独作用于棉纤维时，只有7%溶解，C1+Cx可提高到50%，而C1+Cx+β-葡萄糖苷酶，则棉纤维溶解可达59%。

对于C1酶和Cx酶的协同作用有人是这样解释的：首先由Cx酶在微纤维上一些特定的薄弱的位置把纤维分子链打断，C1酶接着深入到纤维分子链把氢键打开，这样，就使一段段纤维断片从微纤维上脱落下来。脱落的纤维素断片再经Cx酶和β-葡萄糖苷酶作用，分解为葡萄糖（见图5）。也有人认为C1是一种亲和因子，它促使水解因子（Cx）结合到固体纤维素上，进行水解。

目前对C1酶的了解仅限于假说阶段，由于纤维素高分子结构十分精细，同时C1酶“固相”作用非常复杂，这无疑给C1酶研究带来很多困难。

内间（1→4）-β-葡聚糖酶首先作用于较长的链，使黏度迅速下降。内间的键易分解，二端的键较难分解。在底物溶解度的限度内（DP3-6），随着DP的增加，水解速度也增加，它不能水解纤维二糖。纤维素的化学改变影响对酶的敏感性，一般增加纤维素的溶解度，水解速度也加快；但取代基的存在将有效防止邻近它的键的水解。取代度增加，水解速度也降低，但只要有相邻的二个葡萄糖基不被取代，就能被酶水解。因为内间酶与底物结合至少要有二个没有改变过的葡萄糖单位，至于酶作用的键则是邻近的一个葡萄糖苷键。

外端（1-4）-β-葡聚糖酶能连续不断地将单个葡萄糖从纤维素的非还原端一个一个切下。在绿色木霉中的纤维二糖酶可能属于这一类酶。它们能迅速水解内间酶作用产物4～7个葡萄糖单位的纤维寡糖，在纤维变糖中起着重要的作用。它们作用的专一性很强，对纤维素衍生物或具有混合键及分枝链的葡聚糖作用很有限。

β-葡萄糖苷酶、水解纤维二糖或其他分子较小的纤维寡糖变成葡萄糖。分解二聚糖和三聚糖很快，分子再大，水解速度就迅速下降，β-葡萄苷酶除作用β（1→4）键外，还能作用β（1→1）、β（1→2）、β（1→3）、β（1→6）键，它还有葡萄糖基转移作用，能被葡萄糖内脂强烈抑制。

C1、Cx和β-葡萄糖苷酶也许可以再分，因为它们分别柱层析，等电焦点法式电泳可进一步分成几个峰。这些酶可能起着同功酶的作用。

3）分子量和氨基酸组成

不同酶组分的相对分子质量作了测定（见表3）。

绿色木霉的C1酶可能是一种糖蛋白，相对分子质量为60 000。内间-（1-4）-β-葡聚糖酶分子量变动较大，从5 300～55 000。较小的颗粒可能是“正常”酶的亚基。外端-β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的相对分子质量分别为76 000和50 000。有人认为葡萄糖苷酶的分子通常大于内间酶。

对一些内间（-1-4）-β-葡聚糖酶的氨基酸组成作了分析。在某些场合，碱性氨基酸占优势，有些则是酸性氨基酸占优势。天门冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨较多，含S氨基酸（半胱氨酸）通常很少（少于总量的2%）。另一个值得注意的现象是不同的酶组分中都含有多聚糖。含量从1%～50%，如β-葡萄糖苷酶主要含多聚甘露糖，还有微量多聚半乳糖。这些糖与酶的不同结合，也导致了酶组分的多样性。