菌斑的形成与结构
现有观点认为，牙周病是多因素疾病，牙周病的发生、发展可受其他局部刺激因素和全身因素的影响，其中细菌微生物及其代谢产物是牙周病的始动因子，参与牙周病发生发展的全过程。口腔是人体主要的细菌库，主要的微生物包括需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌，还有螺旋体、支原体、真菌、古细菌、病毒和原虫等。正常情况下，口腔中的细菌微生物可相互制约并与人体共生共栖，最大限度地利用口腔局部微环境进行生长，刺激机体的免疫系统，宿主也能有效对其进行控制，防止细菌微生物侵入组织。当正常菌群间无法互相制约，牙周致病菌的数量增加及毒力增强或宿主的防御能力下降时，细菌微生物与宿主间的平衡被打破，即可出现牙周组织疾病。
（一）牙菌斑生物膜
细菌微生物广泛存在于自然界中包括海洋、土壤、船舶等，动植物及人体内不同种类的微生物间均会形成复杂而有序的聚集体即生物膜（biofilm）。通常情况下，生物膜是由不同的细菌微生物及其碎片所组成，几乎能在任何湿润的表面上迅速形成并不断生长。生物膜的形成和发展与人类的许多疾病密切相关，现有观点认为，人类至少有65％的感染性疾病与生物膜有关。牙菌斑生物膜（dental plaque biofilm）被认为是人体中最常见的生物膜结构，是由基质包裹的互相黏附或黏附于牙面、牙间或修复体表面的软而未矿化的复杂的细菌群落，不能被水冲洗或漱掉。通过电子显微镜观察发现，牙菌斑生物膜主要包括细胞外基质、囊泡和小管样结构，生物膜中的微生物构成相互有序生长的生态群体，各种细菌长期共存，在不同的微环境中发挥各自的作用。与自然界中其他的生物膜一样，牙菌斑生物膜的结构复杂，包括细菌微小群落、胞外基质和液体通道，在口腔菌群的生存及致病性方面均发挥重要的作用。牙菌斑生物膜中的细菌种类可超过500种，这些细菌微生物组成复杂的微生物生态系统。牙菌斑生物膜根据其所在部位的不同可分为位于龈缘上方的龈上菌斑生物膜（supragingival plaque biofilm）和位于龈缘下方龈沟内的龈下菌斑生物膜（subgingival plaque biofilm）。龈上菌斑生物膜主要分布于龈缘附近和牙面的窝沟、裂隙和龋洞等不易清洁的部位，主要以革兰氏阳性需氧菌和兼性菌为主，与龈上牙石的形成、牙龈炎和龋病的发生密切相关。龈下菌斑生物膜根据是否与牙根表面接触，可进一步分为附着性龈下菌斑生物膜（attached subgingival plaque biofilm）和非附着性龈下菌斑生物膜（unattached subgingival plaque biofilm）。附着性龈下菌斑生物膜附着于暴露在牙周袋内的根面牙骨质上，菌斑的结构、成分与龈上菌斑相似，其优势菌主要以革兰氏阳性兼性厌氧菌和厌氧菌为主，与龈下牙石的形成、牙周炎和根面龋的发生有关。非附着性龈下菌斑生物膜为结构松散的菌群，主要分布于龈沟上皮、结合上皮和袋内上皮，主要为革兰氏阴性厌氧菌和许多能动菌及螺旋体，与牙周炎的快速发展和牙槽骨的快速破坏密切相关。
健康状态下，定植于龈沟内的细菌数量为100～1000个，其中约75％的细菌为兼性革兰氏阳性球菌，革兰氏阴性杆菌仅占13％左右。牙菌斑生物膜中的微生物对宿主无害，为口腔正常菌群，与宿主间表现为和谐互利的关系，不会对机体造成损害，可抑制外源性微生物，刺激宿主的先天免疫系统，提高宿主抵抗致病微生物的能力。但正常菌群不是固定不变的，当局部微环境出现改变，正常菌群失去互相制约或与宿主间的平衡被打破，菌斑中的致病菌将会对牙周组织造成损害，造成牙周组织的破坏。在慢性龈炎位点，所培养出细菌的数量可为1万至100万个，所含有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的比例近似相等，革兰氏阴性杆菌可占细菌总量的40％左右。在慢性牙周炎时，大量细菌定植于牙面，单个牙面可定植的细菌数量可为10万至1亿个，细菌组成具有患者差异性及口腔位点差异性，其中革兰氏阴性杆菌约占牙周炎相关致病菌总量的74％。尽管已从牙周袋中分离出500多种细菌，但仅有一小部分细菌为牙周致病菌。Socransky等人根据其聚集性及与牙周状况的关系将常见的菌斑微生物分为红、橙、黄、绿、紫、蓝6种不同颜色的微生物复合体。其中，包含牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌（Tannerella forsythia）、齿垢密螺旋体（Treponemas denticola）的红色复合体被认为与牙周炎，特别是牙周袋深度和探诊出血紧密相关，在牙周病的诊断方面有重要意义。
（二）牙菌斑生物膜的结构特点
牙菌斑生物膜并非细菌在结构上的简单叠加，而是一个复杂的微生物群落，具有特定的结构和生理功能。不同的细菌菌群被获得性薄膜和胞外基质所包裹，内部为大小不等的水性通道所间隔，通道内部有液体流动，呈三维立体状（图1-11）。每个细菌菌群是一个包含数千种相容细菌的微小独立群体，每个独立的菌群可能含有不同的细菌种类。不同细菌菌群间的环境条件（包括氧浓度、pH值和温度）的差异很大，提示不同的菌群在生物膜内都有不同的环境偏好。对菌斑内氧溶解量的测定结果发现，细菌群体内部几乎无氧，为厌氧生存，而水性通道内则发现有效浓度的溶解氧，提示邻近水性通道的细菌为需氧生活，这种差异使同一生物膜内的不同细菌均能和谐地一起生活，某种菌群的代谢产物可作为其他菌群营养物的来源，因此菌斑内微生物可不依靠宿主获得所需要的营养物质，具有较强的抵抗外界环境变化的能力，在低营养状态下可长期存活。例如，某些产酸菌如链球菌（Streptococcus）、乳酸菌（Lactobacillus）和放线菌（Actinomyces）的碳水化合物代谢副产物乳酸盐可为其他细菌如韦荣球菌（Veillonella）和丙酸杆菌（Propionibacterium）提供所需要的碳原子。而韦荣球菌和丙酸杆菌所产生的甲基萘醌类是维生素K合成的重要成分，可促进卟啉单胞菌、普氏菌（Prevotella）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的生长。牙菌斑生物膜的另一个重要特点是可抵抗宿主的防御成分或抵抗药物渗入，使细菌对抗菌药物的敏感性降低，菌斑生物膜中的细菌与浮游状态相比对常抗菌剂的抵抗性更强。体外研究发现，要达到同样的抗菌效果，菌斑中抗菌药物的浓度是细菌浮游状态时的250倍。对成熟菌斑而言，单独应用抗菌药物如四环素、多西环素、米诺四环素、阿莫西林、甲硝唑或将阿莫西林和甲硝唑联合应用均不能有效消灭菌斑微生物。其他研究还发现，与浮游状态相比，牙菌斑中牙周主要致病菌牙龈卟啉单胞菌对多西环素和甲硝唑的抗药性分别提升了60倍和160倍。尽管对其具体的作用机制迄今尚未完全阐明，目前学者们普遍认为菌斑生物膜中细菌代谢状态的改变、细胞生物膜的屏障作用、细菌抗氧化能力的提高及细菌密度感应效应与菌斑中细菌的耐药性有关。
图1-11 牙菌斑生物膜结构图（许雄程医师提供）
（三）牙菌斑生物膜的形成
牙菌斑生物膜具有高度的结构性，菌斑生物膜的形成包括获得性薄膜的形成、细菌的黏附和共聚、菌斑生物膜的成熟3个阶段（图1-12）。牙齿表面在彻底清洁后几分钟即可通过选择性吸附富脯蛋白、富酪蛋白等唾液蛋白形成几微米厚的唾液蛋白薄膜层，此即获得性膜。获得性膜是牙菌斑生物膜形成的基础，获得性薄膜形成后，口腔内的一些细菌微生物即初级定植菌即可通过特定的分子相互作用黏附到牙表面的获得性膜成分而定植于牙面上，形成菌斑生物膜的最初形态。现有研究发现，在菌斑形成早期（4小时），初级定植菌主要为革兰染色阳性的链球菌（Streptococcus），其中以轻型链球菌（Streptococcus mitis）、血链球菌（Streptococcus sanguis）和口腔链球菌（Streptococcus oralis）为主。除了链球菌，其他如奈瑟氏菌（Neisseria）、罗氏菌（Rothia）和革兰氏阳性杆菌如内氏放线菌（Actinomyces naeslund naeslundii），甚至牙周致病菌如洛氏普雷沃菌（Prevotella loesche losecheii）、牙龈卟啉单胞菌、梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和微小微单胞菌（Parvimonas micra）也可发现于早期牙菌斑生物膜中。
图1-12 牙菌斑生物膜的形成过程（许雄程医师提供）
初期细菌定植于牙面后即可产生包括多糖、脂类、蛋白和细胞外DNA等细胞外基质。这些胞外基质对菌斑生物膜的结构、完整性和耐药性而言十分重要。初级定植菌还可为后续的细菌定植提供附着表面，不同种属细菌表面间的特异性识别黏附被称为共聚。在菌斑成熟过程中，细菌通过黏附和共聚相互连接，定植菌迅速繁殖、生长或扩散，随着菌斑中的细菌数量和种类不断增加，形成更为复杂的菌群，最终形成特殊的结构。在菌斑成熟过程中，菌斑中的细菌组成也逐渐发生变化，从以革兰氏染色阳性球菌为主逐渐转变为以革兰染色阴性菌为主，包含球菌、丝状菌和螺旋体等。菌斑的不断积聚和成熟最终导致牙龈炎症的出现。
在菌斑生物膜的形成和成熟过程中，细菌间的交流发挥着重要的作用，细菌之间存在相互传递信号的特殊机制，细菌可产生某种自体诱导物（autoinducer）和化学物质的信号分子，并根据其浓度的变化来调控细菌的数量。主要的信号分子包括自体诱导物多肽（autoinducer peptides，AIPs）、自体诱导物-1（autoinducer-1，AI-1）和自体诱导物-2（autoinducer-2，AI-2）。革兰氏阴性菌以AI-1为信号分子，主要为酰基高丝氨酸环内脂类（acyl homoserine lactone）；革兰氏阳性菌以AIPs为信号分子；AI-2信号分子可由革兰氏阴性菌和阳性菌共同产生。随着细菌密度的增加，自体诱导物浓度也相应增加，当达到一定的临界值时，能启动细菌特定基因的表达或关闭以适应外界环境，这种现象称为密度感应（quorum sensing，QS），所产生的信号分子被称为密度感应信号。细菌可借由QS系统调控不同的细菌代谢活动，如菌斑生物形成、细菌间黏附和聚集、细菌毒力因子的启动、细菌抗药性和基因间的转换等，因此对QS系统的研究有望成为细菌感染性疾病治疗的突破口。
由于牙菌斑生物膜是引起和加重牙周病的始动因素，因此消除和控制菌斑的形成是牙周治疗的重要手段。控制牙面上的菌斑生物膜最好的办法就是物理性破坏菌斑生物膜。在定期清洁的部位，成熟的生物膜将无法形成。牙齿表面越干净，菌斑结构就越简单。由于牙刷和牙线不能接触到位于牙周袋内的龈下牙菌斑生物膜，因此定期进行对龈下牙根面进行洁刮治，是牙周治疗中的重要组成部分，也是最经济有效的治疗手段。