1.1.3　免疫组织化学染色

（1）石蜡切片脱蜡至水。

①在60℃烤片2h，立即放入histone clear 1中（室温）5min；②histone clear 2中（室温）5min；③histone clear3中（室温）5min；④100%乙醇1、2中（室温）各5min；⑤95%乙醇1、2中（室温）各5min；⑥75%乙醇中（室温）5min；⑦PBS中（室温）5min。

（2）抗原修复：使用以0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）进行抗原修复，100℃，抗原修复20min，自然冷却20min后，将片子浸入PBS内5min。

（3）消除内源性过氧化物酶活性：3%H2O2室温孵育10min，PBS冲洗（5min×3次）。

（4）5%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育20min；吸去血清，滴加含1%BSA（PBS稀释）经一抗稀释液稀释的RND3（兔源型，1∶200，实验室制作），Notch1（兔源型，1∶200，abcam，ab27526，USA），4℃过夜；PBS冲洗，5min×3次。

（5）滴加试剂盒中的生物素标记二抗，室温孵育20min；PBS冲洗，5min×3次。(https://www.daowen.com)

（6）滴加试剂盒中的辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育10min；PBS冲洗，5min×3次。

（7）DAB显色剂显色。

（8）利用梯度脱水法脱水并封片，烤干后存放于4℃冰箱中备用。

（9）照相：采用双盲法采集图片，每个标本采集3张免疫组织化学染色的图片（20倍视野）。

（10）采用Leica Appliation Suite V4软件对视野内的所有阳性结果进行定量分析。