二、材料和方法

二、材料和方法

（一）实验材料

从武汉大学动物实验中心购出4～6周龄雄性的BALB/c裸鼠，平均体重15～20 g，在第一临床学院动物实验中心SPF级环境中进行饲养。动物实验中所用器械如医用手术刀、眼科剪、眼科镊以及眼科缝线等均由第一临床学院动物实验中心提供。其他主要材料及设备见表5-3-1。

（二）动物饲养

取上述准备好的BALB/c裸鼠，设置饲养条件：恒温（24～26℃）、恒湿（60％～85％）、无特定病原体。提供经消毒处理的笼具、垫料、饮水和饲料，进行无菌操作。饲养3～5天后，待裸鼠生长情况良好，接种肿瘤细胞。

1.人结肠癌细胞HCT-116细胞的培养

1）细胞复苏

将配制好的RPMI-1640培养基预先放入超净工作台中。从液氮罐中取出之前处理好的细胞冻存管，迅速置于预先设置为37℃的温水中迅速摇动，进行快速解冻后，1000 r/min离心5 min。加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，并将其接种至培养瓶中，放入37℃、含5％CO2的培养箱中培养。在显微镜下观察细胞的贴壁情况，3～5天更换新鲜的培养基，并置于培养箱中继续培养。

2）细胞传代(https://www.daowen.com)

从培养箱中取出细胞，先用酒精灯外焰灼烧培养瓶瓶盖及瓶口。弃去培养液，加入PBS清洗2次，每次6 mL。加入0.25％胰蛋白酶1 mL进行细胞消化，置于显微镜下观察，待大部分细胞变圆变亮后，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基终止消化。吹打细胞悬液，并将液体转入离心管中。1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入新鲜培养基吹打重悬细胞，取适量分别装入新的培养瓶中，放入37℃、含5％CO2的培养箱中培养。每3～5天可传代1次。实验中取处于对数生长期的细胞进行实验。

2.裸鼠皮下种植模型的建立

将处于对数生长期的人结肠癌细胞HCT-116细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化后，1000r/min离心5 min，用PBS吹打细胞使之重悬，并再次离心，从而达到清洗细胞悬液中血清的目的，之后加入PBS调整细胞浓度，并用细胞计数板进行计数，至细胞浓度为1× 107/mL，每个离心管分别取200μL的细胞悬液。

将准备好的裸鼠随机分为3组，每组3只。首先将动物专用实验工作台用酒精棉球擦拭消毒，以75％乙醇消毒裸鼠右下背部皮肤，并用1 mL注射器注入细胞悬液，在右下背部皮下接种结肠癌细胞（（2～5）×106），缓慢推注建立皮下移植瘤模型。定期观察裸鼠生长情况和瘤体，记录其出现的时间及体积。成瘤后每7天用游标卡尺测量肿瘤大小，按照公式计算肿瘤体积（V）（mm3）=π/6×长径（mm）×宽径2（mm2），根据计算的肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线。接种后30天采用脱颈法处死裸鼠，记录肿瘤体积及形态。将移植瘤分为两部分，一部分新鲜肿瘤组织放入-70℃低温冰箱中备用，另外一部分用4％多聚甲醛固定以备行免疫组化。

3.免疫组化法检测AKT基因的表达

免疫组化又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特定的抗原-抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位测定的一种常用技术。它将免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，并借助显微镜的观察，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。

具体过程如下：将切片放入烤箱中60℃烘烤过夜，操作开始前再次烘烤切片30 min，然后放入二甲苯中脱蜡3次，每次5 min，经常摇晃，换第二缸二甲苯后再次浸泡5 min，冬天温度低时可以适当延长脱蜡的时间。用梯度乙醇进行脱苯：按100％、95％、85％、75％乙醇浓度梯度摆放乙醇，每次浸泡5 min，自来水冲洗2次，每次2 min，去除残留的乙醇。再用TBS冲洗2次，每次3 min；随后将切片放入3％H2O2甲醇溶液中（前者可抑制内源性的过氧化物酶，后者可增加背景，并可能与DAB起作用）浸泡15～20 min，用TBS洗3次，每次5 min，用吸水纸吸净液体。将组织切片放入装有0.01 mol/L、pH 6.0的柠檬酸盐抗原修复液的抗原修复盒中，一起置于微波炉中，先用低火加热5 min，再用中火加热10 min，取出在室温下冷却，当发现液体变温热时，可采用冷水冲洗进行冷却，同时可帮助稀释抗原修复液，取出切片后迅速用自来水冲洗2次，每次2 min，再用TBS冲洗2次，每次2 min，用吸水纸吸干。在擦干的组织部位滴加2％的BSA封闭液，并将切片置于37℃的湿盒中进行封闭，大约20 min，取出切片，将多余的BSA封闭液去除，滴加1∶800稀释的多克隆兔抗人EBP50抗体于组织上，可用TBS进行稀释，均匀覆盖组织后，将切片收入湿盒中，放入37℃温箱中孵育1h，亦可放入4℃的冰箱中过夜。阴性对照切片的处理：上述步骤中除采用完全的TBS代替多克隆兔抗人EBP50抗体外，其余步骤均一样。取出所有的切片后，用TBST清洗3次，每次2 min。用吸水纸擦干切片后，将TBS按1∶100的浓度比来稀释生物素化的羊抗兔IgG，并均匀地将组织标本进行覆盖，然后放入湿盒中，放入37℃温箱中孵育20 min。取出切片后，用TBST清洗3次，每次2 min。吸水纸擦干切片后，在组织上滴加DAB显色，置于显微镜下观察以控制反应时间，观察显色效果满意后，用自来水冲洗终止反应，冲洗时间约5 min。再用蒸馏水冲洗2次后，用苏木精对组织复染1 min，用温水冲洗，直到返蓝后，放入1％的盐酸乙醇中进行分化，大约10 s。将切片依次放入梯度乙醇中脱水：按75％、85％、95％和100％乙醇浓度梯度摆放好乙醇，每次1 min，脱去多余的水分，最后1次需将切片进行干燥处理。再用二甲苯进行透明处理，置于通风橱中让二甲苯挥发，最后用中性树胶封片。

上述实验步骤均重复3次，光镜下观察，阳性表达为出现棕褐色有色化合物。

（三）统计学处理

所有数据均以±s表示，实验结果采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。