四、讨论
当前，尽管各种新的治疗肿瘤的药物不断面世，但基因毒素类化学药物治疗依然是临床上不可或缺的手段。顺铂对肿瘤有明显的治疗效果，但因肿瘤细胞较易对其产生耐药性而在临床应用中受到了一定的限制。如何降低肿瘤细胞对其耐药性的产生成为近来研究的一个热点。
AKT家族包括AKT1、AKT2及AKT3，它们在氨基酸结构序列上具有很高的同源性。AKT1和AKT2在生物体内分布广泛，而AKT3只在特定的组织内分布。AKT均含有PH结构域、激酶催化结构域和调控结构域。细胞外刺激如生长因子、细胞因子和应激反应均可以激活AKT；细胞内酪氨酸激酶受体的改变等也可以激活AKT，进而调节细胞生长、分化及代谢。AKT的活化依赖PH结构域的完整性，与PH结构域相邻的是激酶催化结构域，该结构域中含有一个苏氨酸残基，其磷酸化是激活AKT的关键步骤。AKT信号通路同时参与调控肿瘤的发生和发展。AKT主要发挥抑制肿瘤细胞凋亡的作用，在胰腺癌细胞中AKT通常处于活化状态，其通过磷酸化下游的信号通路分子，来调控肿瘤细胞的生长。化学药物治疗的核心是促使肿瘤细胞发生凋亡，而AKT在肿瘤细胞中持续活化并抑制P53和PTEN等抑癌基因的表达，因此推断，AKT可能参与肿瘤细胞耐药性的产生。目前，众多研究集中在阐述AKT如何在转录水平发挥调控作用，但具体的分子生物学机制仍有待进一步研究。
AKT可磷酸化多种转录因子，通过调控这些转录因子来抑制凋亡基因的表达及增强抗凋亡基因的表达，从而起到抑制细胞凋亡的作用。有研究发现，PI3K/AKT信号转导途径中存在一种糖皮质激素调节激酶FKHRL1，该酶是Forkhead转录因子家族中的重要成员，可调控细胞的生长、分化、代谢和凋亡。研究证实FKHRL1参与细胞增殖及周期调控等。PI3K/AKT信号转导途径通过磷酸化FKHR使其重新转移至细胞质中，进而抑制其在细胞核内的转录功能。AKT除了抑制转录因子Forkhead家族的活性外，亦可参与调控转录因子Bcl-2的活性。在某些细胞中，AKT可上调抑制凋亡基因Bcl-2的表达，在转录因子CREB的协同下，生长因子IGF1与Bcl-2的启动子发生结合从而导致后者发生转录。CREB为AKT直接作用的底物，发生磷酸化后直接与辅助蛋白发生结合，该过程中启动子区域必须包含cAMP反应要素。另外，AKT可促使转录因子NF-κB的表达水平增高。NF-κB参与调节许多生长因子与细胞因子的功能，引起细胞增殖、分化、凋亡及代谢等，其通过诱导AP1等生存基因的表达来促进细胞的生长，这在肿瘤的发生过程中发挥关键作用。在无外源性刺激等情况下，NF-κB在细胞质中与其抑制因子IKKβ发生结合，尽管其本身没有生物活性，但AKT可通过磷酸化IKKα及IKKβ，导致IKKβ发生降解并与NF-κB分离，释放IKKβ后的NF-κB转移至细胞核中并促使靶向基因的表达，在这个过程中AKT发挥了重要的作用。在肿瘤细胞中由于其微环境彻底发生变化，肿瘤细胞可以耐受低氧环境，这种耐受性对肿瘤细胞的增殖及转移具有十分重要的作用。众多研究发现，AKT在辅助肿瘤细胞适应低氧环境中发挥了至关重要的作用。
STATs是一类由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子。STAT家族成员在诸多的肿瘤细胞及组织中存在持续活化，其中以STAT3尤为活跃。STAT3主要包括6个结构域：①Src 2型同源物（SH2）结构域，可促使STAT3与激活后的受体形成复合物，发挥调控靶向基因的作用；②SH3结构域；③酪氨酸磷酸化位点；④DNA结合结构域；⑤丝氨酸磷酸化位点；⑥保守的氨基酸序列。(https://www.daowen.com)
通过实验我们发现，加用顺铂后，AKT的转录水平与蛋白表达水平均增高，与顺铂浓度成正比，提示AKT的表达水平与耐药性形成之间存在一定的联系。但是AKT的表达水平与顺铂的作用时间没有明显的关系。顺铂作用于结肠癌细胞6h时，AKT的表达水平最高，但是具体的分子生物学机制还有待进一步研究。通过实验我们还发现，STAT3可以调控AKT的表达，应用STAT3 siRNA可较明显地抑制AKT的表达，而STAT3质粒可以增强AKT的表达，这从侧面说明STAT3可以调控AKT上游信号通路的信号分子。另外，通过STAT3转录因子与AKT启动子的结合，我们发现AKT启动子的序列中存在与STAT3结合的位点，这说明STAT3可以在转录水平参与调控AKT的表达。
顺铂联合ROS抑制剂NAS可以降低AKT的表达水平，表明ROS可能作为第二信使激活下游的信号通路，进而增强AKT的表达。本研究证实化疗药物在诱导结肠癌细胞凋亡的同时，也可以产生ROS，进而诱导STAT3/AKT的活性增高，而抑制ROS可以提高化疗药物的治疗效果。但是值得注意的是，AKT在调控机体生长发育、防御等方面也起着非常重要的作用，因此如过度抑制其活性则会导致机体出现免疫功能下降等表现；另外，在实验中我们发现顺铂诱导AKT表达的水平与时间不成正比关系，在一定范围内，AKT的表达水平与顺铂浓度成正比，因此可能存在其他信号通路来调控AKT的表达，具体机制还有待进一步探讨。