【实验方法】

【实验方法】

一、处死动物

将出生2～3天的乳鼠用拉颈椎的方法处死。

二、取肾

用自来水浸湿处死后乳鼠背部的被毛，并将其背部向上钉在蜡盘中，用碘酒棉球擦拭其腰部两侧的被毛，再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。在乳鼠腰部的后缘，用解剖镊提起皮肤，再用解剖剪剪开皮肤，将剪开的皮肤拉向两侧，用碘酒与酒精棉球擦暴露的肌肉，再换一把无菌解剖剪及解剖镊，剪开背部的肌肉，暴露出腹腔，即可见肾脏（一般右肾略低于左肾）。用弯头眼科镊取出肾脏，置无菌培养皿中。该步骤须在无菌室或超净工作台中操作。

三、剪肾

用灭菌的眼科剪和眼科镊将肾膜剪破并剥向肾门，剪去肾膜和脂肪，用D-Hanks液洗涤1次，放入另一培养皿内，换一把灭菌的眼科剪和眼科镊，纵向剪开肾脏，去掉肾盂部分，将肾剪成数块，用D-Hanks液洗涤1次，把肾块移入无菌的离心管中。用灭菌的眼科剪将肾剪成1 mm3大小的块，再用D-Hanks液洗2～3次，直到液体澄清为止。

四、消化及分散组织块(https://www.daowen.com)

向上述清洗过的肾组织内加入5～6倍量的0.25%胰蛋白酶消化液，置37℃水浴中消化，消化时间为20～40 min，每隔10 min摇动1次离心管，以便组织块散开。消化至组织块变得疏松，呈黏稠状，并且颜色略变为白色为止。此时，从水浴中取出离心管，在超净台中吸去胰蛋白酶消化液，加入5 mL培养液，用吸管反复吹打组织块，直到大部分组织块分散成均匀的细胞悬液为止。将分散的细胞悬液经滤网过滤至另一个离心管中。

五、计数与稀释

从过滤的细胞悬液中取出1 mL滴在血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数。计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升30万～50万个细胞为宜。

六、分装与培养

将稀释好的细胞悬液分装于60 mm培养皿中，一般3 mL/皿，细胞总量约5×105，在培养皿上做好标记，置37℃的CO2培养箱中培养。

七、观察

每日观察细胞的生长情况，并检查是否被污染。培养物为紫红色，显示细胞生长不好；培养物为橘红色，显示细胞生长良好。经1～2天培养后，若生长较差或培养液变红，应在无菌操作下倒去原培养液，加入新的培养液或维持液（与培养液完全相同，只是所用的血清量为5%）。此后，每隔3～4天更换一些维持液。待细胞基本长成致密单层时，即可进行传代培养。