【实验方法】

【实验方法】

一、MSC的分离培养

1.脱颈处死SD大鼠，剃去大鼠双下肢毛发，浸泡于75%乙醇中消毒皮肤。无菌条件下从SD大鼠双下肢外侧剪开两侧后肢皮肤，去掉肌肉，取股骨与胫骨，浸泡在装有含10 mL PBS的15 mL的无菌离心管中，预先在PBS中加入1%双抗。

2.用镊子取出骨头，置于一次性培养皿皿盖上，用剪刀剪掉骨头两端的骨骺，暴露骨髓腔，用5 mL的一次性注射器分两次共吸取10 mLPBS，用针头插到骨髓腔的一端冲洗，然后换另一端继续冲洗。用100 mm培养皿接取骨髓冲出的细胞悬液，冲洗数次直至骨髓腔变白。

图15-9　骨髓间充质干细胞的分化示意图

3.用移液枪将冲出的细胞悬液全部吸到无菌离心管中，放入离心机，1 000 r/min离心5 min。

4.离心后，去除离心管中的上清液，用移液枪每次吸取1 mL细胞生长液反复吹打细胞，使细胞重悬。

5.因为100 mm的培养皿最多承载10 mL的液体，按浓度稀释，将细胞悬液分装到多个培养皿中。将培养皿放置在含5%CO2的37℃环境中培养。

6.原代细胞培养3天后半量换液，以后每2天半量换液1次。细胞安静放置在培养箱中3～5天后可见大量贴壁细胞，继续培养至10天左右可见明显梭形细胞呈集落分布生长。待细胞生长至80%汇集时即可传代处理。

二、细胞换液

1.从培养箱内取出培养皿，吸出培养皿内全部培养基舍弃，加入2 mL PBS冲洗2遍，吸掉PBS。

2.每个培养皿内加入新鲜完全培养基10 mL，将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。

3.半量换液时，吸取培养皿内一半的培养基舍弃，并加入与吸出量相等的新鲜完全培养基，放入培养箱中继续常规培养细胞。

三、细胞传代

1.从培养箱内取出培养皿，吸出培养皿内全部培养基舍弃，加入2 mL PBS冲洗2遍，吸掉PBS。

2.加入1 mL胰酶，适当摇晃均匀，将培养皿放入培养箱中等待3 min。(https://www.daowen.com)

3.取出培养皿，放置在光学倒置显微镜下观察，若见细胞呈圆形和游离状态即可向培养皿内加入1 mL新鲜完全培养基，终止消化。

4.用移液枪反复吹打细胞液，全部吸取加入15 mL离心管内。放入离心机中，1 000 r/min离心5 min。取出离心管，弃上清液，加入2 mL新鲜完全培养基，重悬细胞，反复吹打均匀。

5.将2 mL重悬的细胞液平均分配至2个新的100 mm培养皿内，再向每个皿各加9 mL新鲜完全培养基至10 mL，轻轻摇晃均匀。置于镜下观察，细胞数量良好。

6.标记好两个培养皿，将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中培养。

四、诱导MSC向神经方向分化

1.分化前准备：使用超声波振动器清洗圆形薄玻片，过夜，放入75%乙醇中浸泡待用。在超净台中将清洗过的圆形薄玻片倾斜放入24孔板内，打开紫外灯照射，并打开超净台内的排风功能，20 min左右吹干圆形薄玻片表面乙醇。在每孔的玻片上加70μL PLL，放入培养箱内2～4 h。取出24孔板，D-PBS清洗3次，最后一次冲洗保留D-PBS备用。

2.接种细胞：将MSCs以5×104个/cm2的密度接种到涂有PLL玻片的培养皿中。当细胞密度达到约50%时，开始进行细胞神经方向分化培养。

3.分化预诱导：将培养基换成含1 mmol/Lβ-ME和20%FBS的L-DMEM，培养24 h。D-PBS清洗细胞碎片。

4.分化正式诱导：换成含有2 mmol/Lβ-ME、200μmol/L BHA和2%DMSO的无血清L-DMEM，培养5 h。

五、细胞免疫荧光检测

1.取细胞爬片，吸掉培养板内的培养液，培养的MSCs细胞用4%多聚甲醛固定20 min。

2.用含有0.1%Triton X-100的2%BSA封闭液封闭1 h。

3.玻片与指定的一抗（1∶1 000）在常温下孵育90 min，经PBS冲洗3次后与相应的二抗（1∶1 000）在室温中孵育1 h，再经PBS冲洗3次后与Hochest33342（1∶1 000）在室温中孵育30 min，再次经PBS冲洗3次后，甘油封片镜检。

六、统计学分析

所有数据以平均值±标准误表示，采用Prime软件进行统计分析。使用t检验确定不同实验组之间的统计学差异，显著性差异设置为P＜0.05。