【实验方法】

一、吸除小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）饲养层的旧培养基，用PBS清洗2次后，换新鲜的人胚胎干细胞培养基。

二、ES细胞培养

1.从培养箱中取出含有hES细胞的培养皿，吸去旧培养基，用PBS清洗2次后加入1 mL胶原酶溶液，孵育5 min左右。为了确定细胞从皿底分离，在显微镜下观察细胞表面。(https://www.daowen.com)

2.缓慢地上下移吸胶原酶溶液，洗涤表面的细胞，将细胞悬液留在培养皿中，直到整个培养皿完成。

3.将含有部分解离的H9人胚胎干细胞细胞团的细胞悬液轻柔吹打几次，加到铺有MEF饲养层的35 mm培养皿中，移至37℃培养箱中培养3～4天，每天观察换液可以看到巢状胚胎干细胞团。

4.一般培养4～5天后可以消化、传代，视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶中。如果看到较多已分化的细胞团，可以进一步克隆和纯化ES细胞。