1.4　类器官的结构与功能鉴定

类器官在体外三维培养环境中能形成与体内组织类似的结构，并具有复杂的细胞与细胞间互作。这就需要对类器官的细胞组成、细胞间互作通信，以及形成的结构与功能进行全面细致的研究，帮助我们理解类器官结构形成的分子调控机制，进一步优化类器官培养方案，并指导类器官在模拟体内组织发育、再生与疾病中的应用。

单细胞测序技术的快速发展，使我们能从单细胞水平深入解析细胞状态的变化以及复杂的细胞间相互作用。目前该技术在类器官鉴定中广泛应用，一方面是解析类器官的细胞组成，与组织发育或再生过程的单细胞测序数据相比较，鉴定类器官中是否具有组织中对应的细胞类型，还可以进一步评估不同细胞的成熟情况；另一方面是鉴定类器官中复杂的细胞与细胞间相互作用，通过受体-配体分析可以建立细胞与细胞间的互作通信网络，帮助理解类器官结构形成的细胞机制。例如，Barbara Treutlein团队通过单细胞测序技术分析了体外肝芽类器官形成过程中不同细胞间的互作，并结合小分子抑制剂功能实验，发现VEGF信号介导了血管网络的形成和肝母细胞的分化［64］。把研究组织发育、再生和疾病发生发展的类器官与单细胞测序技术结合起来，将帮助我们发现组织发育和再生中的调控信号，解析疾病发生过程中细胞病变以及细胞通信变化的分子机制。(https://www.daowen.com)

虽然单细胞测序技术可以提供丰富的单细胞维度上的信息，但缺少了组织空间位置信息，而这些信息对于理解组织结构与功能非常重要。近年来，空间多重原位分析技术快速发展，使得空间的信息得以被挖掘。空间原位分析技术可以分为两大类，一类是利用核酸探针或者抗体来分别定量分析核酸或者蛋白表达的技术，如RNA Fish技术以及基于多种不同抗体的多重原位染色技术；另一类是基于测序和空间位置标注的空间转录组技术［65］。多重原位染色技术在类器官鉴定中应用非常广泛，可用于鉴定类器官中不同细胞组成及功能状态等。近年来多重原位染色技术得到快速发展，新的多重原位染色技术如CODEX（Co-detection by indexing）和MIBI-TOF（Multiplexed ion beam imaging by time of flight）技术也得以建立［66，67］，并已在肿瘤免疫微环境鉴定中广泛应用。利用30～50种不同抗体，可以充分鉴定肿瘤微环境的细胞组成、细胞密度的空间分布、细胞功能状态的变化以及不同细胞形成的空间结构等。而空间转录组技术则能在空间位置信息标注的情况下对组织进行测序分析，结合单细胞测序技术，可以实现对组织空间细胞分布、细胞通信、结构和功能变化等的分析［65］。空间原位分析技术在类器官鉴定中的应用将进一步增加空间维度的信息，帮助理解细胞类型的分布和不同细胞间的相互作用。

近年来长时程实时活细胞成像技术的快速发展，使得在体内或者体外长时程记录观察细胞行为成为可能。例如，何爱彬团队构建了定制垂直光片显微镜的实时成像系统，此外，通过配备的小鼠胚胎培养模块，利用心跳门控成像策略和数字图像处理框架，实现了单细胞分辨率水平的小鼠心脏发育的三维成像，并且可以不间断记录细胞谱系分化1.5天［68］。类器官技术与活细胞成像技术结合可以记录和分析类器官结构的形成过程。Orly Reiner团队建立了人脑类器官芯片，可以在体外模拟人脑褶皱的生理表型。研究人员结合实时活细胞成像技术对人脑类器官体外发育和自组织的过程进行了长达数周的观察分析，发现类器官在临界细胞密度和最大核应变时出现弯曲；进一步发现类器官中心的细胞骨架收缩和表面细胞周期依赖性核扩张两种相反的作用力会造成这种差异生长模式［69］。这项工作为体外研究人脑折叠的物理过程提供了很好的模型，也是一个利用长时程活细胞成像技术深入理解类器官自组织过程的很好的例子。