3.2.2 成体干/祖细胞来源的类器官
肺脏不同区域存在不同类型的干/祖细胞，并且成熟分化的细胞也可以再度进入细胞周期，自我更新或者分化产生新的细胞类型。因此，肺不同区域获得的类器官具有不同的特征。根据研究目的选择不同区域的肺组织提取上皮干/祖细胞进行类器官培养，或同时加入其他细胞类型共培养，可以更好地模拟体内这些细胞的特性。
如上文所述，AT2细胞是肺泡干细胞，在气道中，基底细胞和club细胞具有干/祖细胞活性。此外，小鼠的BASCs和LNEPs也具有干/祖细胞活性。这些细胞都可以构建类器官，总结如图3-3所示，详细内容将在下面的章节展开。
肺成体干/祖细胞来源于新鲜的肺组织。人体肺组织可以从医院，特别是拥有肺移植项目的机构，经科研伦理委员会批准获得捐赠的正常肺组织；还可以从慢性阻塞性肺病（简称慢阻肺，chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、哮喘或肺癌患者的支气管活检或肺切除手术获得组织样本。供体的性别、年龄、吸烟史、确诊时间、是否使用药物和疾病分类等因素都可能会影响类器官生长速度及分化效率。获得组织样本后，利用机械力和组织消化酶获得单细胞或细胞团，包埋在细胞外基质成分中进行3D培养，或者经流式分选出特定细胞类型后进行类器官培养。胶原酶和中性蛋白酶被广泛使用于肺组织的消化［35，36］。
图3-3 肺成体干/祖细胞来源的类器官类型［34］
1.基底细胞来源的类器官
基底细胞是气道中的干细胞，负责产生近端气道上皮的所有细胞类型。来自大气管基底细胞的类器官被称为大气管球（tracheosphere），而来自支气管的被称为支气管球（bronchosphere）。尽管名称不同，这些类器官都具有假复层上皮，外圈是基底细胞，内圈则是分泌细胞和纤毛细胞［37］。2009年，Brigid Hogan实验室首次利用KRT5-GFP＋的小鼠气管基底细胞构建了大气管球。将气管基底细胞包埋于无生长因子的基质胶中，置于0.4μm孔径的Transwell上层培养20天后，形成中空的具有假复层上皮的气道类器官，外圈是P63＋KRT5/KRT14＋的基底细胞，而内圈是表达Acetylated-Tubulin的纤毛细胞［3］。进一步地，利用NGFR和Integrinα6分选人和小鼠的基底细胞，无论有无间质细胞存在的情况下，都可以培养出气道类器官，而人的气道类器官中分泌细胞以杯状细胞为主［3，38-41］。
2.Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的类器官
AT2细胞具有自我更新和分化成AT1细胞的能力，因此是肺泡中的干细胞。原代AT2细胞可以根据表面标志基因分选出来（人AT2：EPCAM＋HTII-280＋，小鼠AT2：EPCAM＋Sca1-）或者利用谱系示踪小鼠（Sftpc-CreERT2；Rosa-td Tomato）分选出荧光标记的细胞。在体内，间质细胞为AT2提供生长因子，因此，最初的肺泡类器官培养中需要加入间质细胞，比如PDGFRα＋肺成纤维细胞［6］、EPCAM-Sca1＋肺间质细胞［42］或者肺血管内皮细胞［43］。AT2细胞与间质细胞共培养在基质胶中大约14天后，形成类器官，被称为肺泡球（alveolosphere）。其中，AT2在外围，而AT1在里面。近年来通过加入间质细胞分泌的细胞因子以及一些小分子抑制剂，已经建立了不依赖于间质细胞的培养体系，实现了人和小鼠AT2类器官的长期培养，并且不再需要血清等化学成分不明确的组分［44-46］。这些因子包括R-Spondin1、FGF7、FGF10、EGF、Noggin、WNT信号激活剂CHIR99021和TGF-β信号抑制剂SB431542。
3.BASC细胞来源的类器官
BASC细胞位于小鼠细支气管-肺泡管连接处，同时表达Club细胞和AT 2细胞的标记基因SCGB1A1和SFTPC，并且具有气道和肺泡两种分化潜能。BASC细胞在气道萘损伤后能分化产生club细胞和纤毛细胞，在博来霉素肺泡损伤后产生AT 2和AT 1细胞［17，47-49］。(https://www.daowen.com)
2005年，Carla Kim等［17］首次报道BASC细胞后，为了进一步在体外研究其特性，于2014年利用BASC表面标记基因Sca1进行流式分选。分选出CD31-CD45-EpCAM＋Sca1＋细胞，与原代小鼠肺内皮细胞（Lu MECs）共培养于无生长因子的基质胶中，置于Transwell上层，14天后能形成肺泡型、支气管型、支气管肺泡型三种类器官［43，50］。其中，肺泡型类器官包含AT1和AT2细胞，分别具有T1α和SFTPC表达，支气管型类器官中具有SCGB1A1阳性的club细胞，FOXJ1阳性的纤毛细胞和MUC5AC阳性的杯状细胞，支气管肺泡型类器官中不仅有AT2细胞、club细胞、纤毛细胞和杯状细胞，还具有SCGB1A1和SFTPC双阳性的细胞。在Lu MEC存在的条件下，BASC可以在体外多次传代，并且克隆形成效率不会随着传代而下降。
4.远端气道干/祖细胞来源的类器官
除了BASC细胞，成体肺中还存在其他具有多潜能干细胞活性的细胞类型。2011年，Harold Chapman团队首次报道了Integrinα6β4＋SFTPC-肺上皮细胞具有肺泡和气道两种分化潜能，并建立了体内肺类器官模型［51］。该团队将成年小鼠的Integrinα6β4＋SFTPC-肺上皮细胞与小鼠胚胎14.5天的肺单细胞悬液混合在一起，移植到免疫缺陷小鼠的肾包膜下，6天后肉眼可见类器官形成，并具有与宿主联通的血管系统。在移植的第2～6天，移植的结构模拟了小鼠肺发育的过程。移植第2天的结构类似于假腺管期，上皮管道被大量间质细胞包围；第4天类似于微管期，既具有立方体细胞排列在上皮管道中，也具有扁平的上皮细胞形成分支结构；第6天则表现为胚胎18.5天的特征，上皮细胞呈现扁平形态。
随后，Harold Chapman和Frank Mc Keon课题组分别报道了小鼠远端气道中存在的一群干/祖细胞，这群细胞表面表达Integrinβ4，在流感损伤后快速增殖、迁移进入肺泡区域，产生大片的KRT5＋基底样细胞。尽管不同的课题组命名不同，有的命名为谱系阴性的上皮祖细胞，简称LNEPs［18］，有的命名为远端气道干细胞，简称为DASCs［52，53］，这些细胞在严重肺泡损伤后都能快速产生KRT5＋基底样细胞，以恢复肺上皮屏障。LNEP细胞随后被证实包含P63＋KRT5-和P63-细胞，P63＋KRT5-细胞负责产生KRT5＋基底样细胞［54，55］，而P63-的细胞则能分化产生AT2细胞［19，54］。体外培养EPCAM＋Integrinβ4＋细胞出现两种类器官，一种为气道类器官，主要包括KRT5＋基底细胞、club细胞和纤毛细胞；另一种为肺泡类器官，包括AT1和AT2细胞［54，56］。
5.club细胞来源的类器官
在肺脏中，除了前文提到的成体干细胞能形成类器官外，还有部分成熟分化的细胞也可以形成类器官，比如分泌细胞。相比于二维（two dimensional，2D）培养，这些细胞在3D环境中能更好地生长，发生增殖和分化，再现了这些细胞在体内的潜能。
人和小鼠的气道中都存在一群分泌细胞club细胞，其标志基因为SCGB1A1。在成体稳态或气道损伤后，club细胞可以自我更新，也可以分化产生纤毛细胞［4］。club细胞中有一个表达UPK3A的亚群，被称为variant club细胞，位于神经内分泌小体（neuroendocrine bodies，NEBs）附近，低表达细胞色素CYP2F2［57-60］。variant club细胞可以抵御萘损伤，并在支气管损伤后重建club细胞和纤毛细胞群体。
2017年，Carla Kim实验室［61］利用Scgb1a1-CreER；Rosa26-td Tomato谱系示踪小鼠经流式分选获得club细胞，将其与LGR5＋或LGR6＋的间质细胞共培养于无生长因子的基质胶，置于Transwell上层，能形成肺泡型、支气管型、支气管肺泡型三种类器官。其中，支气管型类器官大且圆，形成包含club细胞和纤毛细胞的单层腔室；肺泡类器官较小并且致密，AT2细胞在外层，AT1细胞在内层；支气管肺泡型类器官是混合型，既有肺泡也有气道上皮细胞存在。他们发现间质细胞影响了club细胞的分化命运。定位在肺泡区域LGR5＋间质细胞促进了club细胞向肺泡分化，而主要定位在气道周边的LGR6＋间质细胞则促进club细胞向气道分化。
2021年，Joo-Hyeon Lee实验室进一步优化了培养基，通过加入多种生长因子，比如EGF、FGF7、FGF10、Wnt3a条件培养基、RSPO1条件培养基以及Noggin，最终建立了不依赖于间质细胞共培养的小鼠club细胞类器官，具有三种分化命运［62］。此外，Joo-Hyeon Lee团队还利用KDR标记分选出人的分泌细胞（EPCAM＋HTII-280-KDR＋），重悬于无生长因子的基质胶中，以液滴形式培养，在含有EGF、FGF7、FGF10、Noggin、A8301、SB202190的培养基中培养3周后，类器官中club细胞和纤毛细胞为主，有少量基底细胞。
2022年，Edward Morrisey团队发现人呼吸性细支气管部位中存在一类具有干性的分泌细胞，命名为RAS细胞［21］。这群细胞表达SCGB1A1和SCGB3A2。该研究团队利用CEACAM6作为标志基因，经流式分选出EPCAM＋HTII-280-NGFRCEACAM6＋的细胞，重悬于无生长因子的基质胶中，以液滴的形式滴在细胞培养板中，加入肺泡培养基（含有FGF7、CHIR99021、B27、N2、地塞米松、8-溴腺苷3′5′-环单磷酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、TZV），培养21天后大约60%的类器官表达SFTPC。