3.3.2　分子生物学鉴定

HE染色和免疫组化可在组织形态和组织特异蛋白上确定类器官与组织来源的相似性，但这些证据仍然不够，还需要更多的分子水平上的证据，其中类器官的分子生物学鉴定方法有全外显子测序（whole exon sequencing，WES），转录组测序（RNA-seq），尤其是单细胞转录组测序，全基因组测序（whole genome sequencing，WGS），DNA甲基化分析，以及短串联重要序列（short tandom repeat，STR）鉴定。

1.全外显子测序

全外显子测序检测基因组的外显子区域，即蛋白质编码区域。外显子区域虽然仅占基因组1%，但大多数的孟德尔遗传病都与该区域有关，因此全外显子测序是一种广泛应用于临床的高深度测序技术［65，66］。对人体组织及其来源的类器官进行外显子测序，可以分析其特征基因的碱基突变率、碱基突变类型占比、基因拷贝数、染色体的缺失与易位。Se Jin Jang等［67］将肺癌组织与正常支气管组织作为样本进行类器官培养，将培养的类器官与其来源的组织通过HE染色、免疫组化、免疫荧光等技术进行对比，发现衍生而来的类器官在形态学上与其来源的正常组织或肿瘤组织具有良好溯源性，对肺癌类器官及其肺癌原发灶组织进行全外显子测序后发现，肺癌类器官维持了原发灶组织大部分体细胞突变。虽然该研究未对正常肺组织及肺类器官进行全外显子测序，但正常组织与其衍生的类器官在基因组上具有良好的一致性是毋庸置疑的。

2.转录组测序

转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合，主要包括m RNA和非编码RNA。转录组测序是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。对类器官进行转录组测序，可以分析特征基因表达调控的一致性。马少华等［68］通过RNA-seq分析的肺类器官及其来源肺组织，发现其基因表达谱高度一致，表明肺类器官在药物筛选、个体化精准治疗、再生医学等方面较传统细胞模型具备明显的优势。(https://www.daowen.com)

单细胞转录组测序近年来在类器官培养中应用广泛，不仅可用于鉴定类器官中的细胞类型，也能够鉴别出类器官培养过程中的过渡期细胞；结合拟时序分析等方法，还可预测细胞的分化过程。

3.DNA甲基化分析

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组Cp G二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达［69］。Matthias Zilbauer［70］等对人肠上皮类器官和原代肠上皮细胞进行全基因组DNA甲基化和转录组学分析，发现其表观遗传特征具有惊人的相似性。虽然目前尚无专门针对肺类器官及其来源肺组织的DNA甲基化分析，但是基于DNA甲基化分析对表观遗传的特异解析方式应用于肺类器官的鉴定是可行的。

4.STR鉴定

STR是基因位点由长度为3～7个碱基对的短串联重复序列组成，这些重复序列广泛存在于人类基因组中。STR序列符合孟德尔遗传定律，个体间存在相同的短串联重复序列，但重复的次数在个体间存在差异，形成片段长度不等的等位基因，因此STR被称为细胞的DNA指纹［71，72］。因为类器官保留了亲本的复杂性和遗传性，所以STR可以鉴定类器官和来源组织的稳定性，比对结果可说明类器官是否由其来源个体构建而来。