3.4.1　模拟肺发育

小鼠模型的研究逐渐揭示了小鼠肺发育的过程。在小鼠胚胎9.0天时，转录因子Nkx2.1在前肠腹侧的内胚层细胞中表达，从而开启了肺的发育。自E9.5天开始，这些上皮细胞外翻形成气管和肺芽，并完成与食道的剥离。研究表明，Nkx2.1的表达缺失会导致气管和食管结构分离失败从而导致肺严重发育不良［73］。在E12.5-E16.5假腺期，两个肺芽开始分支，产生大树形状的分支网络，这一过程又称分支形态发生。随后是E16.5-E17.5小管期和E18.5至出生后第5天为囊状期，末端分支开始变窄并形成上皮囊簇。最后，肺泡的完全成熟发生在P0-P14肺泡期［74］。在内胚层发育的所有阶段，中胚层（或间质）同步发育并与肺内胚层相互作用以促进分支和分化，其中涉及多种信号通路，例如来自中胚层的FGF10通过作用于肺内胚层的FGFR2来促进肺分支。无论是配体还是受体的基因缺失都会导致肺分支失败［75］，说明了中胚层提供的生长因子对内胚层发育的重要性。除此之外，BMP、WNT、SH H、NOTCH、RA等信号通路也在肺发育中起关键性作用［76，77］。人的肺发育阶段与小鼠的类似，但是受限于伦理问题很难利用人体组织进行研究，人肺类器官为研究人的肺发育过程提供了强有力的模型。

2010年，Magnus Magnusson实验室将人支气管上皮细胞系（VA10）与人脐带来源静脉内皮细胞（HUVECs）共培养在基质胶中可以发生形态分支并且诱导AT2细胞分化，在体外再现了人肺的形态发生［78］。2014年，Aadil Kaisani等发现将人支气管上皮细胞（HBECs）与人胚胎成纤维细胞IMR90共培养于基质胶上可以诱导分支发生，并且出现远端上皮细胞标志物的表达，如SCGB1A1和SFTPA［79］。由于这些支气管细胞受分化方向限制，因此现在更多使用hPSCs来源的类器官研究肺发育。(https://www.daowen.com)

2011年，Michael Green等首次将hPSCs来源的定型内胚层在TGF-β和BMP信号的双重抑制下高效定向诱导分化为前肠内胚层，这为后来肺的发生奠定了基础［80］。2014年，Shimpei Gotoh等率先使用CPM作为NKX2.1＋腹侧化的前肠内胚层细胞（“ventralized”anterior foregut endoderm cells，VAFEC）的表面标志物，在表达SFTPCGFP报告基因的hPSCs和胎儿肺成纤维细胞进行3D共培养中，发现CPM＋VAFECs可以分化为肺泡上皮细胞，并且具有AT2独有的特征：具有板层小体结构，表面活性蛋白SFTPC和SFTPB表达增加［31］。随后，Briana Dye等使用hPSCs在体外培养，通过调节发育过程中重要的信号通路实现了由单层内胚层逐级生成腹侧前肠类球体、肺类器官、近端气道样结构、远端双向分化祖细胞的诱导分化，并且多种类型的间质细胞包围着上皮细胞，具有复杂多样且成熟的细胞类型和肺泡样结构，较好地模拟了不同细胞在体内的空间位置排列，其最终形态被称为人肺类器官（human lung organoids，HLOs）。研究者还使用RNA-seq，证明其体外诱导的HLOs与基于全局转录组（global transcriptional profiles）的人类胎儿肺高度相似［29］。2015年之后，关于hPSCs衍生的肺类器官如雨后春笋般兴起，多项工作更加细致地优化了体外培养条件［81］，使我们对人肺发育的认识更进一步。