3.4.5　模拟肺部肿瘤发生发展

肺癌（lung cancer，LC）是世界上发病率和死亡率最高的癌症类型。肺癌约有11种遗传分化亚型和2种主要的组织病理学亚型。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的85%，另有15%被归类为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）［103］。肺癌的每种组织病理学亚型都有特定的定位和不同的转移特征。对Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者活检样本的单细胞转录组分析显示细胞调节过程、分子肿瘤发展和细胞表型存在显著分化，具有相同组织病理类型的肺癌患者之间肿瘤的遗传、分子和表型特征存在高度异质性［104］。

肺癌体外研究主要依赖于已建立的细胞系，具有诸多局限性，例如缺乏异质性以及与肿瘤微环境的相互作用，并且可能在体外培养时积累遗传和表观遗传畸变。目前，临床前肺癌模型已经发展到包括患者来源的异种移植（patient-derived xenografts，PDXs）和肺癌类器官（lung cancer organoids，LCOs）。与细胞系相比，PDXs和LCOs都再现了亲本肿瘤的遗传和组织学异质性，更真实地反映了肺癌的发病机制。多种研究方式验证了肺肿瘤类器官与原代肿瘤组织在形态学与组织学方面的相似性。肺癌类器官既可以是囊性的，也可以是实性的，单纯从类器官形态上无法区别肺肿瘤类器官和肺正常类器官。在大多数研究中，采用HE染色结合免疫组化对肺癌类器官进行鉴定。不同的肺癌类型来源的类器官高表达不同的蛋白标志物，并与原代组织情况一致，如肺腺癌类器官高表达TTF1、CK7、NAPSIN；肺鳞癌类器官高表达P40、KRT5/6，不表达TTF1；在肺肿瘤类器官中P63表达丧失极性［67］。通过全外显子组测序和评估拷贝数变异、变异等位基因分数（VAF）分布和单核苷酸多态性分析，可比较肿瘤标本和相应的肿瘤类器官的遗传特征。另外，sc RNA-seq是最精确的细胞多样性分析工具之一，可用于验证肿瘤类器官是否还原了原发肿瘤的特征和异质性。

肺癌类器官培养的成功取决于几个不同的因素，包括类器官的形成、长期扩增和肿瘤细胞纯度。正常细胞和肿瘤细胞混合生长时，在某些培养条件下可能会引发正常细胞过度增殖。因此，为提高培养的肺癌肿瘤细胞纯度，应仔细选择原代组织来源和培养基。比如，可从转移组织或恶性积液中获得肿瘤细胞，从而排除正常的肺细胞；与手术切除的肿瘤相比，来自肿瘤核心的活检组织有更高的肿瘤细胞纯度，但同时需注意组织太小会降低类器官构建的成功率。肺癌类器官培养基的选择是肺癌类器官面临的主要挑战，目前的研究致力于确定一种具有选择性的肺癌类器官培养基，例如减少培养基中的细胞因子抑制正常肺细胞的生长，或添加Nutlin-3a对肿瘤细胞进行选择。然而，根据癌症基因组图谱数据，大约40%的肺癌携带野生型P53，Nutlin-3a无法排除正常细胞，且肿瘤间和肿瘤内的异质性也会给培养基的优化带来很大困难。某些肺肿瘤组织在现有的培养条件下不能长成类器官，而某些肺肿瘤组织在所有培养基中都能很好地生长成类器官，包括无血清DMEM/F12培养基，这些现象强调了根据原发肿瘤的特点选择合适的培养基的重要性［105，106］。(https://www.daowen.com)

肿瘤类器官的构建来源于肿瘤干细胞，这些干细胞同时进行自我更新和分化，分别产生干细胞和非干细胞。肿瘤类器官可作为研究癌症干细胞异常自我更新和分化的模型，也可用于研究特定基因突变对肿瘤发生发展的影响。Antonella Dost等研究者使用来自人类iPSC和小鼠肺上皮细胞的类器官系统来模拟肺腺癌的发展，首次利用肺类器官研究正常上皮祖细胞与早期肺癌的转录和蛋白质组学变化，提供了KRAS驱动的肺肿瘤发生的全面分子图景［107］。在iPSC来源的人肺类器官中外源性表达HER2，可诱导形成肿瘤样结构和类似于HER2扩增的肺腺［108］。通过分析不同肺癌类型来源的肿瘤类器官基因表达谱，可发现不同组织类型在免疫调节、炎症和信号通路上的差异。肺癌基因组图谱的复杂性使个性化治疗的实施更加复杂。此外，即使由相同的致癌驱动因素定义的患者亚组也显示出巨大的分子多样性，从而导致患者不同的临床症状和对抗癌治疗的不同反应。患者来源的类器官可用于研究肺癌的临床变异性，而不需要事先对患者的遗传背景进行分析。可以从手术摘取、活检组织或外周血中获得构建类器官的样本，以针对各个时期肺癌患者构建肺癌类器官，模拟肺癌的病理进程。因此，肺癌类器官生物库的建立也为寻找个体特异生物标志物提供了依据。

肿瘤-肿瘤微环境相互作用在支持恶性增殖、化疗耐药、免疫逃逸和转移性扩散中起着关键作用。因此，通过合适的共培养平台观察肿瘤-肿瘤微环境相互作用，对于理解肿瘤发展各个阶段的生物学机制至关重要。类器官是模拟肿瘤-肿瘤微环境之间相互作用的有效工具，比如，目前已建立肿瘤类器官与肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）或免疫细胞共培养模型。肺癌类器官与CAFs共培养，显示CAFs可促进肿瘤细胞增殖和侵袭性［109］。肺肿瘤类器官与自体T细胞共培养可用于分析肿瘤对免疫治疗的敏感性或耐药性的机制，并可能生成患者肿瘤特异性T细胞产物［110］。除在肿瘤类器官培养中，外加其他细胞重构肿瘤微环境外，也有研究通过空气-液体界面共培养（air liquid interface，ALI）系统从肺和其他肿瘤中构建保留内源性肿瘤实质、基质和嵌入的免疫细胞的类器官，代表了原生（或整体）的肿瘤微环境模型，但由于免疫细胞和成纤维细胞不能在ALI系统中长期繁殖，需进一步调整该培养系统以满足不同肿瘤微环境细胞类型的需要［111］。