3.4.6 药物筛选
1.肺类器官应用于药物筛选
肺类器官已广泛应用于药物筛选。Yuling Han等［90］利用人类多能干细胞生成的肺和结肠类器官系统，对FDA批准的药物进行了高通量筛选：将培养好的类器官模拟COVID-19肺部感染后的炎症变化，通过RNA-seq证实了病毒感染，随后对几种SARS-Co V-2的抑制剂进行高通量筛选；发现包括伊马替尼、麦考酚酸和盐酸喹那克林在内的三种药物在生理水平下，可以显著抑制SARS-Co V-2对人类多能干细胞的肺类器官模型（h PSC-LOs）和人类多能干细胞的结肠类器官模型（hPSC-COs）的感染。这表明经过SARS-Co V-2感染的hPSC-LOs，可以作为研究新冠病毒感染和鉴定潜在的COVID-19治疗药物的疾病模型，实现药物的高通量筛选。
2.肺类器官应用于药物筛选的优势与不足
相比于传统的2D细胞模型和动物模型，肺类器官更加接近生理状态下的细胞组成和生理功能。对肺类器官进行基因操作很便捷，不会引起伦理争议。此外，肺类器官在培养过程中经历多次增殖传代并维持基因组稳定性。这些优势使得肺类器官非常适合进行药物筛选和构建肺类器官库。
早期的肺类器官需要大量的起始细胞，其通量低，体外活力较差，不适用于药物筛选。随着多能干细胞、祖细胞的分离技术进步，目前已能获得重复性好、寿命长的类器官；并配合微流控细胞芯片技术，形成了适用于高通量药物筛选的肺类器官模型。然而，肺类器官仍然有不足之处，虽然类器官在体外培养实验中具有自组装、更新以及分化等特点，但是经过几次传代后，细胞活性和功能均会降低；其次，它不具有真正生物体内的血管网络系统，使得营养供给和代谢产物的排出都会成为棘手的问题，并且无法完美展示组织-组织相互作用、组织微环境的情况。再者，肺类器官疾病模型还不够完善，例如目前肺癌类器官基本可以覆盖95%的肺癌类型，但是仍然有一些罕见的肺癌亚型待发展成类器官。以上这些缺陷可能会影响药物筛选的结果。
3.构建肺类器官库
构建肺类器官的生物样本库可以作为有效的药物筛选平台，缩短临床前研究和临床研究的周期，减少新药开发的成本和风险，助力精准医疗和肺部疾病的研究。目前已经有构建好的肺癌类器官库［67］，该器官库建立了肺癌和非肿瘤性支气管黏膜的5种组织学亚型。肺癌类器官库作为一种体外细胞模型，可以维持非常接近体内肿瘤细胞的基因组特征，通过结合基因组测序数据和组织形态可以鉴定出各类肿瘤亚型。
4.肺类器官芯片用于药物筛选
类器官与微流控细胞芯片的结合也是一种新趋势，它不仅拥有器官特定功能，能够模拟器官的生长发育过程，还能精准调控发育过程中的信号分子，做到了实时检测。肺类器官芯片根据肺部结构主要分为肺泡芯片和气道芯片。肺泡芯片将肺泡上皮细胞与血管内皮细胞共培养，主要展现肺泡上皮细胞与大量毛细血管相互交织的空间结构，能够反映呼吸作用时肺泡收缩扩张的机械运动。而气道芯片则是气道上皮细胞和血管内皮细胞共培养，模拟多层次多结构的黏膜功能性单位，以建立屏障功能。此外，还有高通量培养肺类器官的芯片、具有呼吸可视化功能的新型肺芯片、模拟三维肺泡结构的类器官等。
（1）经典的肺类器官芯片
①肺泡芯片（lung alveolus-on-chip）
由哈佛大学Donald Ingber等开发的最早的肺器官芯片是一种肺泡芯片［112］。肺泡芯片成功模拟了人体肺泡的气液界面，以及肺泡在呼吸时受到的肺牵张力。
由图3-4可见，肺泡芯片是面积只有几平方厘米的多孔双层聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）夹膜，上侧植入肺泡上皮细胞，下侧植入毛细血管内皮细胞。从肺泡上皮侧通入空气，毛细血管侧通过培养液，从而模拟人体肺泡的气液平面。另外，在肺芯片两边的侧室进行循环抽真空，模拟胸膜腔随着呼吸运动而扩大和缩小，形成了类似肺牵张力的作用，拉扯PDMS膜，达到模拟肺泡在呼吸时的效果。早期的肺泡芯片主要用于研究固体机械力（肺部上皮细胞周期性的拉伸）和流体机械力（液体表面张力）对肺功能的影响，以及肺泡与免疫细胞和病原体的相互作用、肺泡上皮和内皮屏障功能等。
图3-4 肺泡芯片的结构［112］
模拟人体肺芯片微型装置的设计示意图。（a）模拟人体肺芯片微型装置利用PDMS膜、肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞，形成肺泡-毛细血管屏障。该装置通过向侧室施加真空并导致PDMS膜的机械拉伸，形成肺泡-毛细血管屏障，从而再现生理呼吸运动；（b）在肺吸气过程中，隔膜的收缩会导致胸膜内压降低，进而引起肺泡和肺泡毛细血管界面的物理拉伸
在肺泡芯片的研究基础上，Dongeun Huh利用TNFα不仅诱导出中性粒细胞从毛细血管到肺泡室募集的整个过程，还通过吸入二氧化硅纳米颗粒模拟肺泡机械损伤，成功复制了传统细胞培养模型无法实现的仿生微流体系统。并且构建了肺水肿的病理模型，发现了潜在的治疗药物血管生成素-1（angiopoietin-1）和离子通道抑制剂（GSK2193874）［113］。Haiqing Bai等将H3N2流感病毒引入肺泡芯片的空气通道，感染肺泡芯片，不仅成功观察到流感感染的已知标志发展，还观察到肺泡芯片对H3N2产生了免疫反应，表明利用肺泡芯片可以重现肺部感染H3N2发生的情况。此外，还发现了一种钙结合蛋白S100A7在静态芯片中未检测到，但在应变芯片中高度表达，表明其产生是由机械拉伸诱导的，并且该蛋白表达增加可以上调与先天性免疫反应有关的许多其他基因的表达，包括多种炎症细胞因子［114］。
②气道芯片（airways-on-chip）
最早的气道芯片，是将两层PDMS膜置入上下两个腔室之间，供双侧小气道上皮细胞（small airway epithelial cell，SAEC）的生长和附着（图3-5）。SAEC在膜上生长，并在上腔室和下腔中灌注培养基，直到它们汇合。汇合之后，在上腔通入空气，以在细胞上形成空气-液体界面。该方法可以模拟液态栓塞形成和破裂时压力波对SAEC的损伤［115］。
图3-5 早期气道芯片的结构［115］
（a）早期的小型气道芯片由上腔室、PDMS膜、下腔室组成；（b）SAECs黏附在PDMS膜上，在上下室灌注培养基；（c）一旦SAECs汇合后，在上腔进行通气，形成气-液界面；在气-液界面培养过程中，SAECs进行细胞分化；（d）在小型气道芯片系统中，通过栓塞生成器，重新建立生理气道闭合；（e）栓塞生成器中产生的液体塞在上皮细胞单层上进行，并在下游区域破裂，在体外重新打开小型气道；（f）连续灌流的培养基支持细胞生长为单层，具有典型的上皮外观
但是，双侧SAEC结构不能很好地模拟功能营养单位。Katelyn Sellgren等通过双层PDMS膜将模型分为三个垂直堆叠的腔室：上层的气道上皮细胞腔室、中层的肺成纤维细胞腔室和底层的微血管内皮细胞腔室，并且用原代细胞代替了永生化细胞系（图3-6）［116］。这样的结构重现了三层细胞的空间排布，已经应用于多种呼吸系统疾病的研究。Alexander Nesmith等重现了人类哮喘时肌肉组织的结构和功能特征，证明了HA1077靶向抑制Rho A介导的收缩，可以有效缓解IL-13引起的过度刺激［117］。Kambez Benam等通过构建健康人和COPD患者的小气道芯片模型，有节律地控制烟雾的进出，观察到了分子、细胞、组织水平上，健康人和COPD患者在吸烟时引起损伤反应的差异［118］。
图3-6 Katelyn Sellgren等设计的气道芯片结构［116］
（a，b）PTFE和PET膜的扫描电子显微镜图像；（c）其展开图和示意图；（d）在三个流体通道中有染料的10×1 mm装置的照片；（e）10×1 mm装置截面的光学显微镜图像
相较于肺类器官，肺芯片技术既能实现接种细胞的增殖和分化，又能满足仿生组织中层次结构的重现，是对肺类器官技术的一种补充和拓展。肺器官芯片通过微流控技术对流路的控制，解决了持续新鲜培养基及后续药物的供给问题，也通过工程手段部分模拟了在体器官的功能。但是由于其培养的细胞仍是2D细胞，因此仍然存在不能完全模拟生理状态的局限性。(https://www.daowen.com)
（2）肺芯片最新进展
①集成超疏水微孔阵列芯片
在肺癌领域，肿瘤类器官模型的构建和应用受限于效率和耗时等问题，肿瘤体外药敏预测的开展较其他癌种更为困难。Yawei Hu等首先建立了一种有效的机械样本处理方法，处理了103例手术切除的肺癌组织样本，用以制备肺癌类器官，该过程保留了亲代肿瘤的组织学和遗传学特征，能在长期体外培养和传代后保持稳定，并具有无限扩增的潜力。为加快药敏检测的进程，该团队研发了一种集成超疏水微孔阵列芯片（integrated superhydrophobic microwell array chip，InSMAR-chip）用于LCOs的高通量培养与分析（图3-7）［119］。该芯片表面注入了超疏水涂层，由于接触角大于160°的超疏水表面的排斥作用，使得微孔之间有物理隔绝，保证了每个微孔独立的液体环境，便于加样和换液的操作，当过量的培养基从芯片中吸出时，可在微孔阵列中自发形成均匀的培养基液滴阵列。另外，微孔间距与1536孔板保持一致，更适配商用的成像和检测仪器。由于芯片微孔结构体积为纳升量级，大大缩短了药敏检测时间，结果显示数百个LCOs可在一周内产生具有临床指导意义的药物反应，表明自制的InSMAR-chip比观测基因突变更能反映肿瘤耐药性，可用于探究患者治疗反应。
图3-7 在微孔中具有液滴阵列的InSMAR-chip芯片图［119］
（a）InSMAR芯片原理图（左）和芯片横切面图（右）；（b）微孔中液滴阵列的InSMAR芯片照片；（c）上图当多余的培养基从芯片中吸出时，培养基的液滴阵列自然形成；中图：用电子移液器将Matrigel液滴阵列装入微孔；下图：用斑点覆盖法将基质液滴覆盖在培养基上
②具有呼吸可视化功能的新型仿生3D肺器官芯片系统［120］
该系统具有生理尺度的肺泡阵列，并在芯片结构上涂敷颜色材料，通过颜色变化来对肺器官芯片的伸缩进行实时监测。由于肺器官芯片在运行过程中的规律循环变形，可以模拟有节奏的呼吸时肺泡的扩张和收缩，以及结构形变所引发的结构颜色的同步变化，使得该芯片系统可提供细胞力学方面的自动监测（图3-8）。
该芯片采用阵列方式在芯片的上下两层进行气体和液体的分布，来分别模拟相应的气道呼吸或血液流动，在呼吸过程中循环气流会被引入肺器官芯片上的肺泡结构，来重现呼吸过程中的节奏，在结构颜色结合下，不同的机械结构形变大小会呈现不同的视觉效果（图3-9）。
图3-8 具有呼吸可视化功能的新型仿生3D肺器官芯片的结构［120］
（a）规律呼吸情况下的肺泡示意图；（b）当循环气体流入到仿生3D肺器官芯片装置时，再现了呼吸过程中有节奏的拉伸；结合结构的颜色，呼吸过程表现出细胞的机械性视觉效果
通过对肺芯片上的肺细胞进行表征，发现在动态拉伸的条件下，F-激动蛋白（绿色）可呈现更为致密和完整的单层细胞，并且反映细胞间紧密连接的标记物ZO-1（红色）也有很明显提升（图3-10）。通过改变循环拉伸强度来对肺泡的形变进行监测发现，低气流下（15 k Pa）和高气流下（30 kPa）肺泡在循环峰值处PDMS薄膜的形变颜色波长范围不同，更高的形变会使波长范围增大，同时在15个呼吸周期下，不同位置反射位移值也因气流的增强而变大。
最后，该团队利用TGF-β处理构建了肺纤维化模型。通过循环拉伸来抑制成纤维细胞增殖并诱导细胞外基质成分分泌。利用构建好的IPF芯片，该团队发现了二甲双胍和羟氯喹是IPF的潜在治疗方案，且羟氯喹的效果可能比二甲双胍更好。
③模拟三维肺泡结构的类器官芯片
Di Huang等［121］利用反蛋白石结构与肺泡结构的高度相似性，成功以甲基丙烯酸酐化水凝胶（gelatin Methacryloyl，Gel MA）为基质，构建了类生理结构、会“呼吸”的三维肺泡结构。同时，外围的PDMS芯片既可以通过位于Gel MA支架下方的微流控通道为其中的肺泡上皮提供营养，实现气-液培养模式，还可以通过控制芯片单元的两侧真空腔运动，赋予芯片呼吸功能（图3-11）。肺泡内壁附着肺泡上皮细胞，在周期性“扩张-收缩”作用下，肺泡可吸入不同气体，如空气、烟、新冠病毒等。该研究证明，这种三维支架比二维平面更有利于肺泡上皮细胞的生长和功能化。
图3-9 形变程度不同的肺泡有不同的视觉效果［120］
具有自主神经的人类肺芯片系统的表征显示。（a）肺泡的截面视图；（b）肺泡的明场图像；（c）HFL-1/HPAEPIC的扫描电子显微镜图像；（d）光学显微镜下特定位置结构颜色变化的图像，肺泡用红色虚线圆圈表示；（e）不同视角的彩色PDMS膜的动态反射率波长
图3-10 肺芯片上肺细胞的特征［120］
（a）在低气流（15 k Pa）条件下的PDMS薄膜变形示意图；（b）在低气流下，通过数值模拟计算了PDMS薄膜在循环峰值时的变形；（c）在低气流下，肺芯片的肺泡在15个呼吸周期里不同位置的反射位移值；（d）在高气流（30 kPa）条件下的PDMS薄膜变形示意图；（e）在高气流下，通过数值模拟计算PDMS薄膜在循环峰值时的变形；（f）在高气流下，肺芯片的肺泡在15个呼吸周期里不同位置的反射位移值
图3-11 逆向工程的肺泡芯片示意图［121］
会呼吸的人类肺泡肺芯片，图示远端肺、呼吸周期和呼吸肺泡肺的体外芯片模型
基于此芯片，构建了吸烟引起的肺急性损伤模型和伪新冠病毒感染模型，并在伪新冠病毒感染模型中探究发现几种抗病毒药物，包括阿莫地喹（amodiaquine）、瑞德西韦（remdesivir）和羟氯喹（plaquenil），对于细胞病变均有显著的抑制作用。