4.2.1 简单肝脏类器官的构建
肝细胞和胆管细胞是肝脏中两种主要的功能细胞。简单肝脏类器官包括肝细胞类器官和胆管细胞类器官（图4-3）。肝细胞类器官表现为形态良好的肝实质样聚集，相比二维培养的肝细胞具有细胞极性增加和肝向功能提高等优势。胆管类器官常表现为囊状中空结构，并具有胆汁吸收和液体转运等功能。本小节将描述简单肝脏类器官的构建方法以及结构与功能特征。
1.肝细胞类器官
肝细胞类器官主要是利用PSCs分化或者直接转分化获得的类肝细胞、原代肝细胞通过体外细胞自组装形成的。
图4-2 肝脏类器官构建的发展历史
图4-3 肝细胞类器官和胆管类器官的构建
（1）多能干细胞的分化
从人类胚胎干细胞（human embryonic stem cell，h ESCs）和人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）中产生组织特异性细胞类型的方法促进了人类发育和疾病的新型体外模型构建的发展。多项研究工作已经证明，通过模拟体内肝脏发育原理，在体外培养过程中逐步添加相关的生长因子或化学小分子可以实现细胞分化并生成功能性肝细胞，其可以作为一种重要的肝细胞来源，用于肝细胞类器官的构建［3］。
胚胎发育过程中，肝细胞起源于内胚层，因此根据胚胎发育原理，多能干细胞首先需要在Activin A的诱导下分化为内胚层细胞群。在内胚层细胞形成后，向培养体系中添加FGF4和BMP2诱导肝向命运分化。随后，利用HGF和KGF等生长因子促进肝母细胞扩增，并用oncostatin M（OSM）、Dexamethasone进一步诱导分化出肝细胞群［14-16］。人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）来源的类肝细胞在代谢研究和细胞治疗等方面的应用都依赖于类肝细胞的成熟代谢功能。研究者们发现hPSCs来源的类肝细胞自组装形成三维类器官可以促进类肝细胞的成熟［17］。程新团队证明肝细胞类器官也可以通过从人内胚层干细胞直接分化构建，他们建立了大规模生产制备可满足移植细胞数量需求的悬浮培养系统［18］。
（2）重编程肝细胞的自组装
类肝细胞除了能由PSCs分化获得之外，还可以通过重编程成纤维细胞获得。强制激活肝向分化的关键转录因子可将成纤维细胞直接转分化为类肝细胞，该过程被称为肝细胞的转分化。小鼠成纤维细胞在Gata4、Hnf1a和Foxa3过表达诱导下能够转分化为类肝细胞，其具有与成熟肝细胞相似的基因表达谱。过表达FOXA3、HNF1A和HNF4A能够使人胎儿成纤维细胞（human fetal fibroblasts，HFFs）、成人成纤维细胞（human adult fibroblasts，HAFs）和成人脂肪组织的间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cell，AD-MSC）通过重编程高效生成人诱导类肝细胞（human induced hepatocyte-like cell，hi Hep）。hi Hep表现出成熟肝细胞的功能，特别是药物代谢相关的CYP酶活性等，可以用于药物开发、再生医学和组织工程等［19-22］。重编程获得的类肝细胞在低贴附板中能够自组装形成三维肝细胞类器官。重编程获得的类肝细胞的肝向功能包括白蛋白（ALB）分泌和药物代谢等都显著提高，并且形成了胆小管、微绒毛和细胞间紧密连接等结构，表明肝细胞类器官获得了成熟肝细胞的结构和功能特征［23］。
在机制上，Hippo信号的激活被认为是肝细胞类器官成熟的关键。在小鼠诱导类肝细胞（induced hepatocyte-like cell，i Hep）自组装形成过程中，肌动蛋白重组和细胞间黏附诱导Yap失活，并上调Hnf1α表达。Hnf1α进一步作为核心转录因子，调控i Hep细胞类器官中肝向基因的表达，并诱导i Hep细胞的生长停滞和功能成熟［24］。
（3）原代肝细胞的自组装(https://www.daowen.com)
肝细胞在体内具有强大的增殖能力，但在早期的研究中，受限于培养技术无法实现其体外的长期扩增，而且原代肝细胞在体外培养中会快速丢失肝向功能。近年来，细胞培养技术的突破使得体外扩增培养原代肝细胞成为可能。因此，体外扩增培养的原代肝细胞也成为构建肝细胞类器官的另一个重要细胞来源［3］。
Wnt靶基因Lgr5标记了由Wnt信号驱动的自我更新组织（如小肠、结肠、胃和毛囊）中增殖活跃的组织干细胞。来自组织中的Lgr5＋干细胞能够在三维培养系统中长期扩增，并形成对应的类器官，保留来源组织的诸多结构和功能特征［25-27］。虽然健康小鼠肝脏中不表达Lgr5，但在肝脏损伤后Wnt信号高度激活，胆管附近会出现少量Lgr5＋细胞，在肝脏修复中生成肝细胞和胆管细胞。从成年小鼠肝脏中流式分选出的损伤诱导的Lgr5＋细胞，可以在基质胶中自发形成三维类器官。向培养基中添加EGF、FGF10、HGF、R-spondin 1和烟酰胺能够维持Lgr5＋细胞在体外长期培养12个月。抑制类器官的Notch和TGF-β信号可以在体外诱导肝向命运分化，分化后的类器官高表达成熟肝细胞标记物G6pc、Alb、Cyp3a11、Fah等，但是前体细胞特征基因Lgr5的表达下调［28］。有研究表明胚胎小鼠肝脏组织来源的Lgr5＋肝母细胞可以在体外扩增为具有双向分化潜能的祖细胞群，并自组装形成类器官［29］。
从小鼠肝脏组织分离出的原代肝细胞可以在Wnt激动剂（R-spondin1、CHIR99021）、TGF-β抑制剂（A83-01）或炎症细胞因子TNFα的诱导下，模拟体内肝细胞在慢性肝脏损伤过程中发生去分化过程，实现体外扩增并自组装形成三维类器官［30-32］。其中，胡慧丽等发现Wnt激动剂诱导的小鼠肝细胞类器官可以在体外扩增约2～3个月，同时保留肝细胞的关键形态、功能和基因表达特征［31］，而Roel Nusse团队发现TNFα诱导的类器官可以长期增殖约6个月［32］，并且这些增殖的小鼠肝细胞类器官具有和体内部分肝切除术（partial hepatectomy）后增殖肝细胞相似的基因表达特征。
肝细胞在损伤状态下的可塑性特征除了被应用于体外扩增培养小鼠原代肝细胞外，也被用于建立人原代肝细胞体外扩增培养方法。在损伤过程中，肝细胞可被重编程为增殖性肝前体细胞（hepatocyte-derived proliferative ducts，HepPD）［33，34］。肝细胞到HepPD的转化可能经历双表型的中间细胞状态，其特征是共同表达肝细胞标记物和前体细胞相关标记物。利用特定的培养条件诱导原代肝细胞在体外向双表型中间细胞状态转变，结合低氧环境，能够实现人原代肝细胞的体外长期扩增培养，为人肝脏类器官培养提供了新的细胞来源。当这些可扩增的双表型细胞重新聚集并自组装为三维类器官时，它们重新分化，表现出成熟肝细胞的功能和基因表达特征，丢失前体细胞的基因表达特征［35，36］。从人胎儿肝脏组织中分离获得的原代肝细胞也能够用于建立类器官。人胎儿肝脏来源的类器官能够在体外维持培养几个月，并表现出肝脏类似的结构、功能和基因表达特征［31］。
2.胆管类器官的构建
胆管类器官的构建主要集中在两方面，一是通过PSCs分化和细胞自组装构建胆管类器官；二是胆管组织中分离的胆管细胞在体外三维培养自组装形成胆管类器官。
（1）多能干细胞分化的胆管类器官
在胚胎发育中，胆管细胞分化自肝母细胞，这一分化过程是由祖细胞表达的Notch2和门静脉间质细胞表达的Jagged1相互作用介导的。同时，Notch信号也参与调控了胆管的形态发生过程。Mina Ogawa等诱导PSCs分化为内胚层细胞群后，通过添加b FGF和BMP4可以实现内胚层细胞肝向命运分化。在PSCs分化为肝母细胞后，将其与表达多种Notch配体（包括jagged1）的OP9基质细胞共培养，模拟发育过程中的多种信号调控，诱导肝母细胞向胆管细胞分化和成熟［37］。Ludovic Vallier团队发现activin、FGF10和维A酸（retinoic acid）在早期胆管细胞或胆管前体细胞分化过程中发挥关键作用。他们发现activin和维A酸可以抑制肝母细胞的标志物AFP、HFN4A和TBX3的表达，而添加FGF10可以诱导早期胆管特异的标志物SOX9、HNF1B和CK19的表达。他们基于该培养体系建立了诱导hiPSCs来源的肝母细胞高效地向胆管前体细胞分化的方法，但是获得的胆管前体细胞并不表达成熟胆管细胞的标志物。为了促进胆管前体细胞的成熟，他们将胆管前体细胞进行三维培养并发现这些类器官表达成熟胆管细胞的标志物并形成胆管特异的结构［38］。程新团队证明了胆管类器官也可以直接由人内胚层干细胞分化形成，他们发现激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号可以促进胆管谱系分化。形成的胆管类器官表达胆管的特征基因，包括KRT7，AQP1，CFTR，GGT1和SLC4A2，并且其表达水平接近培养的原代胆管细胞的水平［18］。
（2）原代胆管细胞的自组装类器官
从成人肝脏组织分离的人原代EpCAM＋胆管细胞，能够在含有Wnt激动剂（Rspondin 1）、c AMP激活剂（Fosklin）和TGF-β抑制剂（A83-01）的三维培养条件下扩增为具有双向分化潜能的前体细胞，并维持增殖状态3个月。扩增后的细胞能维持染色体结构的高度稳定，其自组装形成的类器官显示出典型的导管样结构，并同时表达干细胞标记物PROM1和LGR5，以及胆管标记物SOX9和ONECUT2［39］。
肝内胆管具有复杂的分支结构，发挥了将胆汁运输到十二指肠的功能［1，40，41］。胆管细胞排列在这些管道中，为胆汁提供物理屏障，并改变其成分［42，43］。前文提到的多项工作已经开发出了PSCs和原代胆管细胞来源的胆管类器官，能够形成由单层胆管上皮细胞形成的管状或囊状结构，但不具有胆管分支结构。Floris J.M.Roos等将原代胆管细胞在常规胆管类器官培养条件下［39］培养3天后，更换培养基为“分支胆管诱导培养基”，其中含有经典Wnt信号激动剂（R-spondin 1）和抑制剂（DKK1）且不含TGF-β抑制剂（A83-01），建立了分支胆管类器官（branching cholangiocyte organoids，BRCOs）［44］。
（3）肝外胆管类器官
胆管树是一个复杂的管状系统，包括肝外胆管（extrahepatic bile ducts，EHBDs）和肝内胆管（intrahepatic bile ducts，IHBDs），负责肝脏产生的胆汁和胰腺分泌物的引流、储存和浓缩［45］。肝外胆管按解剖区域划分，包括肝总管、胆囊（gallbladder，GBD）、囊管、胆总管（common bile duct，CBD）和胰管（pancreatic duct，PancD）［40，45］。从细胞来源的角度看，IHBDs来源于肝母细胞，而EHBDs与腹侧胰腺具有相同的胚胎起源［41］。肝外胆管细胞转录谱和生物学功能等都存在区域多样性，其中GBD组织高表达与胆汁修饰相关的主动代谢过程相关的基因，包括异种生物、脂质和胆固醇代谢相关的基因。不同EHBDs解剖区域（CBD、GBD和PancD）来源的类器官能够在经典Wnt信号激活的条件下培养并自组装成胆管类器官，表达成体干细胞的标记物，如LGR5和PROM1。不同解剖区域来源的EHBDs类器官在体外培养后依然能够部分保留与来源组织相似的表达谱特征。但是，只有IHBDs类器官具有双向分化能力，能够在特定肝向诱导条件下表达肝细胞标记基因［46］。IHBDs和EHBDs类器官之间的差异可能和不同解剖位置细胞的胚胎起源、基因表达和生物功能差异有关。