4.2.2 复杂肝脏类器官的构建
由单一肝细胞或胆管细胞形成的简单类器官尽管已经能部分模拟细胞间的互作，并形成部分体内的组织结构，但是简单类器官的结构与功能与体内肝组织差距甚远，缺少肝组织中的血管网络、免疫微环境等重要成分，使其在模拟组织发育、再生和疾病等方面存在明显不足。因此，构建结构与功能高度仿真的复杂肝脏类器官是一个重要而热门的研究方向。近年来，复杂肝脏类器官的构建虽然处于初级阶段，但是已经取得了不少进展。
1.肝胆类器官
肝细胞类器官和胆管类器官都能通过PSCs或者原代细胞三维培养来进行构建，但是构建肝、胆细胞共存并实现肝细胞和胆管结构仿真的类器官（这里称为肝胆类器官）是构建复杂肝脏类器官的一大挑战。通过模拟肝脏发育经由PSCs共同分化获得肝细胞和胆管细胞是构建肝胆类器官的重要技术手段。由于肝细胞和肝内胆管细胞在发育上来源于共同的祖细胞肝母细胞，因此可以通过模拟发育的信号调控来诱导PSCs分化获得肝母细胞，然后进一步由肝母细胞同时双向分化获得肝胆类器官。Yuan Guan等建立了诱导hiPSCs双向分化成表达肝细胞和胆管细胞标志物的类器官，但是该培养体系获得的肝胆类器官是混合物，包含三种类器官，即主要表达肝细胞标志物的肝细胞类器官、囊状结构的胆管类器官以及肝细胞和胆管细胞共存的类器官［47］。Fenfang Wu等也建立了通过诱导hiPSCs双向分化获得肝细胞和胆管细胞共存的培养体系。虽然胆管细胞在该培养体系中形成了三维结构，但是肝细胞是二维生长的，并没有真正构建三维肝胆类器官结构［48］。
上述两项工作虽然实现了hiPSCs双向分化同时获得肝细胞和胆管细胞，但是所形成的肝胆共存体系并没有体现肝胆组织间的互作与功能。Yun-Shen Chan团队通过hiPSCs分化获得肝母细胞类器官，随后，他们建立了2步分化方案，即先逐步撤去Wnt信号，然后抑制Notch信号及添加BMP7和FGF19信号从而促进肝母细胞类器官的进一步双向分化。在该培养条件下培养24天，肝母细胞可以形成中心紧实的细胞团而周围形成囊状结构的三维类器官。他们进一步鉴定发现中间紧实的细胞团是ALB＋的肝细胞，而周围囊状结构则是CK7＋胆管细胞。他们证明了这些类器官同时具备肝细胞和胆管细胞的功能，并发现这些肝胆类器官能建立有功能的胆汁排泄系统，可以模拟曲格列酮诱导的胆汁淤积性损伤。此外，还发现在高脂的培养条件下，肝胆类器官可以模拟代谢性脂肪肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）诱导的胆小管网络的结构变化，并引起胆管细胞的扩增，体现了肝胆类器官在模拟胆汁淤积或胆管损伤相关疾病的应用价值［49］。这项工作首次证明了PSCs获得肝胆类器官的潜能，并可以模拟肝胆组织的结构与功能。
除了通过PSCs分化获得肝胆类器官，目前也有工作通过原代肝细胞和胆管细胞共培养来模拟肝胆组织的结构与功能。Naoki Tanimizu等通过三明治培养体系将小鼠的肝前体细胞（small hepatocyte，SH）与EpCAM＋胆管细胞进行共培养。他们也发现SH可以与胆管细胞形成功能性的胆汁吸收和排泄系统，并利用该模型在体外模拟了胆汁吸收和排泄的过程［50］。但是值得注意的是，这项工作所采用的三明治培养方式都是平面单层细胞培养，所以肝细胞和胆管细胞并没有形成体内有序的三维结构。尽管肝胆类器官培养体系有待于进一步优化，但是上述所有工作为构建肝胆组织积累了宝贵经验，并提供了不同的研究思路。
2.血管化类器官
肝脏是高度血管化的组织，肝脏特异的血管-肝窦血管在维持肝脏结构与功能方面发挥重要作用。血管化肝脏类器官的构建主要包括两个方面：一是将类器官移植到体内形成血管网络；二是体外构建血管化类器官。
2013年，Takanori Takebe等将PSCs分化获得的肝脏内胚层细胞与人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞共培养，通过细胞自组装形成“肝芽”类器官。分析肝脏发育中连续上调的83个基因后，发现体外培养4天的“肝芽”类器官与人胚胎肝脏细胞形成的“肝芽”类器官具有相似的表达谱特征［51］。但是，体外“肝芽”类器官并没有形成可灌注的功能性血管。他们进一步将类器官移植到严重免疫缺陷小鼠的颅窗，并实时观测“肝芽”类器官中血管与宿主血管之间的连接，结果发现48小时内“肝芽”类器官即可与宿主建立连接。通过灌注荧光素连接的dextran和小鼠CD31抗体进一步证实“肝芽”类器官的血管可与宿主血管连接并且具有可灌通性。功能性血管的建立可以促进“肝芽”类器官的成熟，并且可以挽救药物诱导的致死性肝衰竭小鼠［51］。
2017年，美国麻省理工学院Sangeeta N.Bhatia团队利用生物工程技术构建了一个结构有序，包含人原代肝细胞、内皮细胞和基质细胞的工程组织单元（engineered tissue unit）［52］。他们发现将该组织单元异位移植到Fah基因缺失的免疫缺陷小鼠肠内脂肪垫中可以响应连续循环的损伤和再生信号，并且相比于无损伤的对照组，移植的肝组织单元在循环损伤条件下可以平均扩增11倍。他们也发现移植的肝组织单元在体内可以形成可灌注的血管，允许宿主的红细胞通过血管进入移植的肝组织单元。他们发现一个有意思的表型，即工程构建的不同组织形态的肝组织单元对体内损伤和再生信号的响应不同，这可能是不同组织结构影响了不同细胞间的相互作用以及旁分泌信号的浓度梯度，进而影响了其对损伤和再生信号响应的结果。上述两项工作都是依靠体内诱导信号实现了肝脏类器官的血管化构建，对实现肝脏类器官体内移植治疗具有重要意义。
关于体外构建血管化肝脏类器官目前也有工作报道。Yoonhee Jin等建立了一个微流控细胞培养装置，该装置允许营养物质和代谢产物的连续交换。为了模拟体内肝脏组织的细胞外基质微环境，他们通过脱细胞技术获得了猪肝脏的细胞外基质并制备成水凝胶。然后进一步将直接转分化获得的类肝细胞——iHep细胞与人脐静脉内皮细胞共培养在细胞外基质水凝胶中，肝脏类器官在微流控培养装置中可以形成血管网络［53］。但是在这项工作中，他们并没有鉴定血管的可灌通性，尚不清楚形成的血管网络是否能运输营养物质。但是，血管网络的形成促进了肝脏类器官的成熟，提高了肝脏类器官ALB分泌、尿素合成和CYP3A4代谢酶活性水平。血管化肝脏类器官表现出对对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）药物毒性更强的响应能力，体现了其在药物诱导的肝脏毒性测试方面的应用潜力。Boyang Zhang等利用生物工程技术制造了一种支架，称为AngioChip［54］。AngioChip可以贴附内皮细胞，从而形成三维有分枝并且可灌注的人工微血管网络。在AngioChip管壁上加入纳米孔和微孔可提高渗透性，在生物分子刺激下允许细胞间的相互作用和内皮细胞的向外生长。AngioChip能够在一个机械可调的基质上培养实质细胞，形成血管化组织。该血管化组织能够直接进行手术吻合与宿主血管进行连接。他们将大鼠原代肝细胞和10%大鼠原代成纤维细胞与基质胶混合后注入支架的实质腔室中，利用细胞自组装和基质重塑构建了血管化肝组织。然后测试了血管化肝组织对抗组胺药特非那定的代谢作用，发现肝组织能将特非那定代谢为非索非那定，表明血管化肝组织能维持肝脏解毒代谢能力。但是需要注意的是，人工构建的血管网络限制了内皮细胞与肝细胞和基质细胞间的互作，对于进一步组织结构的形成是不利的。(https://www.daowen.com)
上述两项工作都是以实现类器官血管网络构建为主，而形成的肝脏组织结构与体内还相差较远。为进一步模拟肝脏的组织结构，中国科学技术大学邱本胜团队基于肝脏基本结构单元特征仿生制造了肝小叶芯片［55］。为了简化肝小叶芯片的设计，他们假设肝小叶为规则的六棱柱，将肝小叶芯片设计成六边形棱柱结构，在棱柱六个顶点设计了门静脉（portal vein，PV）端，在六边形边缘中心位置设计了肝动脉（hepatic artery，HA）端，而在棱柱中心设计了中央静脉（central vein，CV）端，从而模拟肝脏中血管结构特点和血流方向。这项工作中独特的PV、HA和CV流道设计，克服了连续构建多个肝小叶的困难。他们将从小鼠肝脏中分离获得的肝细胞和其他非实质细胞与胶原混合后注入芯片的培养腔室中，细胞培养基分别从PV和HV端流入培养腔室然后从CV端流出。在该培养条件下，肝窦内皮细胞可以自组装形成血管网络并且部分血管呈现放射状排列。肝细胞可以维持ALB分泌、尿素合成、胆汁酸分泌等功能和代谢酶CYP1A2、CYP2E1与CYP3A4活性达28天。为了模拟生理状态下肝脏PV和HV血液中氧气的浓度，他们进一步设计了氧气浓度调节芯片，并通过该装置调节进入PV和CV端培养基中的氧气浓度。他们发现氧气浓度对血管形成有显著影响，生理条件下的PV和HV氧气浓度可以促进血管网络的形成，并且利于规则血管网络结构的形成。此外，生理条件下的PV和HV氧气浓度也有利于更好地维持肝细胞的功能，一旦改变该氧气浓度，肝细胞的功能将显著下调。在这项工作中，研究者通过工程技术仿生设计了肝小叶结构，并进一步结合细胞自组装在体外初步建立了肝小叶模型，为构建结构与功能更加仿真的类器官模型提供了新的思路。上述工作让我们体会到生物学、工程学和材料学多学科融合在组织构建中的强大潜力。
3.肝细胞与非实质细胞互作类器官
除了构建肝胆类器官和血管化类器官外，研究者们也在积极构建肝实质细胞与其他非实质细胞互作的类器官。肝脏中HSC和Kupffer细胞在肝脏纤维化和肝脏炎症相关疾病中发挥重要作用。为进一步模拟肝细胞与这些非实质细胞的互作，拓展肝脏类器官在肝脏疾病模拟中的应用，研究者们正在构建含有这些非实质细胞的类器官。Tomasz Kostrzewski等建立了三维微流控装置，将人原代肝细胞与HSC和Kupffer细胞在该装置中进行共培养，并利用该共培养模型研究了NASH疾病相关表型［56］。Kyung-Jin Jang等建立了双流道器官芯片，将原代肝细胞与细胞外基质以三明治形式培养在实质细胞腔室内，而非实质细胞LSEC、Kupffer细胞和HSC则培养在与之相对的非实质细胞腔室内。为了模拟肝细胞与非实质细胞之间的互作，两个细胞腔室间通过多孔薄膜分隔开，允许细胞间信号分子的交流。他们发现该肝组织芯片可以模拟药物诱导的肝细胞和非实质细胞的损伤表型，如APAP对肝细胞的毒性损伤以及集落刺激因子-1受体（colonystimulating factor-1，CSF-1）抑制剂JNJ-1对Kupffer细胞的毒性损伤。他们还利用该肝组织芯片模拟了氨甲嘌呤（methotrexate，MTX）诱导的肝脏脂肪变性和纤维化病理表型。这两项工作利用组织工程技术实现了肝细胞与非实质细胞互作模型的构建，为构建复杂肝脏类器官模型提供了思路。
原代非实质细胞来源非常有限，大规模扩增和应用存在很大困难。Mar Coll等建立了hiPSCs分化为HSC类似细胞（hiPSC-HSC）的方法，获得的hiPSC-HSC能发挥HSC储存维生素A的功能。他们发现将hiPSC-HSC与HepaRG肝细胞共培养可以自组装形成三维结构，并促使hiPSC-HSC维持静息状态［57］。原代HSC在体外培养时很容易激活，较难在体外研究肝纤维发病机制，而这项工作则为研究肝纤维化相关疾病提供了新的模型。Takanori Takebe团队则建立了诱导hiPSCs同时分化获得含类肝细胞和非实质细胞类器官的方法。他们先诱导hiPSCs分化获得前肠（Foregut）类器官，然后将前肠类器官包裹在基质胶中并用含视黄酸的培养基培养4天，最后用促进肝细胞成熟的培养基继续培养至20天。通过单细胞测序分析，发现在肝脏类器官中存在5个不同的细胞类群，其中类肝细胞群占59.2%，胆管细胞群和胆管树干细胞群分别占3.8%和5.1%，HSC细胞群和Kupffer细胞群则分别占31%和0.8%［58］。这是首次实现通过hiPSCs分化获得含肝细胞和非实质细胞肝脏类器官，虽然不同细胞的比例、细胞间的定位以及类器官结构与肝组织还存在很大差异，但是该研究为构建复杂肝脏类器官奠定了基础。
4.肝脏与其他器官互作类器官
单一组织类器官无法反映在损伤、疾病和治疗状态下不同器官之间的相互作用。近年来，多器官互作系统的建立已成为类器官领域内研究的一大热点。
Takanori Takebe研究团队通过模拟多器官发育在体外首次实现了肝-胆-胰多器官互作类器官的构建［59］。肝-胆-胰区（hepato-biliary-pancreatic，HBP）在前肠和中肠之间的边界被特化［60］，并形成一个上皮泡，从原始肠道向腹侧内陷。HBP谱系的进一步分化可能是由边界区域相邻间充质细胞来源的BMP信号通过间接抑制后肝芽细胞中SOX9基因表达介导的［61］。因此，在复杂微环境中连续动态器官的发育可能由临近组织间连续的相互作用驱动。
基于这一系列体内器官发育研究的发现，他们建立了体外诱导多器官发育的方法。首先在含有FGF4和CHIR99021培养条件下，通过添加或不添加BMP拮抗剂来诱导定向内胚层细胞向前肠或后肠细胞命运分化，第7天，SOX2＋前肠细胞和CDX2＋后肠细胞聚集形成三维球体；然后，将前肠与后肠球体进行融合，融合的球体进一步包裹在基质胶中进行培养。他们发现在不添加任何外源因子的情况下，培养第10天时，HBP原基出现在融合球体的界面上，HBP原基表达早期肝脏标记物H HEX，以及前庭、十二指肠和胰腺祖细胞标记物PDX1。第11天，在边界区同时表达PDX1和H HEX的细胞数量显著增加。他们进一步将培养13天的PROX1＋HBP类器官切割出来并在气-液界面培养系统中培养90天，发现HBP类器官表达胰腺细胞标志物PDX1和NGN3，肝细胞标志物PROX1，以及胆管细胞的标志物CK19和SOX9，表明存在胰腺、肝脏和胆管三种不同组织区域。结果发现，HBP类器官中胆管与胰腺组织区域具有功能性连接，允许胆汁酸的流通，表明HBP类器官不仅含有多器官成分，还建立了多器官之间的互作。
除了通过模拟发育原理来构建多器官互作类器官，组织工程技术的快速发展为构建多器官互作系统提供了另一种策略。哥伦比亚大学Gordana Vunjak-Novakovic团队设计了一种“多器官”组织芯片，通过为每个组织提供各自特异的培养条件、血管连接组织，以及选择性可渗透的血管屏障将血管和组织隔室分开，从而实现多器官的集成［62］。他们设计的组织芯片包含4种组织：肝脏、心脏、骨骼和皮肤。这些组织细胞是由hiPSCs分化获得的，并与基质细胞在生理相关的细胞外基质中共培养形成三维类器官，在各自分化成熟的培养条件下成熟4～6周，然后转移到组织芯片中并通过血管进行连接。结果发现这些组织类器官能维持相应的结构和功能超过4周。多器官互作系统的构建目前处于研究的初级阶段，但是已经积累了不少经验，未来这方面的研究将是单一组织类器官向复杂人体生理系统构建迈进的重要研究方向。