5.3.2　胰岛类器官的鉴定

胰岛是胰腺内负责血糖调控的内分泌功能单元。原代胰岛组织是直径为100～300μm的致密实心球体。成体干细胞来源的胰岛类器官和干细胞体外定向分化获得的胰岛类器官是最主要的两种胰岛类器官，它们均具有与原代胰岛组织相似的实心球体形态，且直径大小与原代胰岛也相近［24，45］。

在细胞组成方面，现有的胰岛类器官与原代胰岛相同，均包含多种可以分泌血糖调控激素的内分泌细胞类型，例如α细胞、β细胞和PP细胞等。但是值得注意的是，不同培养体系产生的胰岛类器官内各种内分泌细胞的比例可能与原代胰岛相比存在较大差异。成熟的胰岛β细胞除了表达激素INS之外，还表达关键转录因子NKX6-1和MAFA、特异性的表面标志物CD49a以及多种重要的功能蛋白；成熟胰岛α细胞表达激素GCG和关键转录因子ARX，可以分化为成熟胰岛α细胞的多激素前体细胞同时表达激素INS和GCG。单细胞转录组分析（single-cell transcriptome analysis）可以对样品的细胞组成及比例在单细胞水平上进行鉴定，Douglas Melton团队使用单细胞测序技术对多能干细胞体外定向分化得到的胰岛类器官进行了分析。他们发现由于多能干细胞的胰岛分化效率较低并且存在分化不同步的问题，胰岛类器官内的细胞组成除了成熟的胰岛α细胞、β细胞和PP细胞之外，还存在少量的前体细胞、胰导管样细胞、腺泡样细胞和高表达TPH1的肠嗜铬细胞（enterochromaffin cell）［46］。但是，在妊娠期母体，胰岛为了满足自体和胎儿对胰岛素的需求，也会出现增殖能力较强并且高表达TPH1的β细胞前体亚群［47］，因此胰岛类器官中表达TPH1细胞亚群的确切属性需要进行进一步的研究。(https://www.daowen.com)

胰岛最为重要的生理功能是分泌胰岛素和胰高血糖素调控机体的血糖稳态，因此对于胰岛类器官的功能鉴定，主要分析其对葡萄糖刺激的响应能力，以及移植后的体内血糖调控能力。葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验（glucose-stimulated insulin secretion assay，GSIS）是鉴定胰岛类器官体外功能的最直接和最重要的方法，使用低浓度和高浓度的葡萄糖缓冲液循环刺激胰岛类器官后，通过检测胰岛类器官缓冲液中分泌的胰岛素和胰高血糖素量表征其对葡萄糖刺激的响应能力。通常多能干细胞来源的胰岛类器官在高糖缓冲液中的胰岛素分泌量是在低糖缓冲液中的胰岛素分泌量的2～3倍［34，35］，而成体干细胞来源的胰岛类器官可达到5～10倍［24］，与原代胰岛组织接近。此外，灌流实验（perfusion assay）也可用于检测在连续时间范围内胰岛类器官对于不同浓度葡萄糖刺激的响应，与GSIS相比，灌流实验的采样时间点更加密集和连续，因而可以反映胰岛类器官分泌胰岛素和胰高血糖素的动态过程［45］。移植实验是检测胰岛类器官血糖调控能力的“金标准”。免疫缺陷小鼠在腹腔注射链脲霉素（streptozocin，STZ）后，其分泌胰岛素的胰岛β细胞发生特异性地损伤，进而出现与糖尿病患者相似的高血糖症状。移植实验是将胰岛类器官移植到高血糖小鼠的肾包膜下后，评估胰岛类器官在体内逆转糖尿病小鼠高血糖表型的能力。糖尿病小鼠在移植多能干细胞来源的胰岛类器官后3周左右，空腹血糖即可恢复至正常水平［34，35］，成体干细胞来源的胰岛类器官移植通常仅需要1～2周即可逆转糖尿病小鼠高血糖表型［24］。