7.2.1　人骨骼肌类器官构建的主要种子细胞

骨骼肌类器官的种子细胞包括胚胎干（embryonic stem cells，ESs）细胞、诱导多能干（induced pluripotent stem cells，iPSs）细胞和成体肌肉干细胞（muscle stem cells，MuSCs）。ESs细胞和iPSs细胞能够在体外大量扩增，理论上能够提供大量的种子细胞。如何高效定向诱导人ESs或iPSs细胞分化为肌纤维，是选择这类种子细胞的重要技术关键。目前从人ESs或iPSs细胞诱导为肌肉细胞的方法分为转基因和化学诱导法两种。转基因法是指基于对骨骼肌发育和再生机制的研究，向ESs或iPSs细胞中通过病毒感染等方法引入促进肌肉细胞分化的关键调控基因，如Pax3、Pax7、Myo D等［1 3］。化学诱导法是指基于对骨骼肌发育和再生分子机制的理解，模拟体内的发育分化过程，用多种化学分子分步向骨骼肌细胞诱导［46］。转基因法一般能够在较短的时间内获得较高的分化效率。但是由于引入外源基因，一方面无法完整地模拟人骨骼肌的发育分化过程，另一方面，在后续应用中需要充分验证细胞的安全性。化学诱导法的安全性较高，但是一般耗时较长，分化效率相对较低。建立安全高效的人ESs/iPSs细胞的骨骼肌定向诱导分化方法依然是制备人骨骼肌类器官所面临的重要挑战之一。

除了ESs/iPSs细胞之外，来源于成体骨骼肌组织的肌肉干细胞或肌肉前体细胞（成肌细胞，myoblast）也是制备人骨骼肌类器官的重要种子细胞。肌肉干细胞是定位于骨骼肌中的成体干细胞，能够在体外和体内高效分化为肌纤维［7，8］，分化所得的肌纤维具有较高的成熟度。但是原代肌肉干细胞需要从临床骨骼肌样品中获得，细胞来源较为有限，细胞数量非常少，因此需要在体外进行大量扩增。与多数成体干细胞类似，肌肉干细胞在体外保持干性且大量扩增是应用肌肉干细胞构建骨骼肌类器官的关键难点之一。通过研究肌肉干细胞在体内的微环境，并在体外对其进行模拟，目前已经建立了一些在体外对肌肉干细胞进行较长时间传代培养的系统，在体外扩增传代20代以上的肌肉干细胞在移植入体内后依然能够支持骨骼肌的多次再生，回归正确的干细胞巢（niche），保持完整的干性［9］。对肌肉干细胞的干性保持机制进行进一步深入研究，鉴定更多能够保持肌肉干细胞干性的因子，进一步完善功能性肌肉干细胞体外扩增体系，均是应用肌肉干细胞作为种子细胞的关键科学问题。(https://www.daowen.com)

应用上述种子细胞，通过自组织的方式可以获得一些具有一定功能的骨骼肌类器官。例如，应用人多能干细胞及iPSs细胞，通过自组织的方式构建了神经-肌肉类器官（neuromuscular organoids）［10，11］。目前的研究表明，在胚胎发育过程中，中胚层向体节、体节进一步向肌肉分化的过程目前看来不需要有机械力的刺激。通过自组织方式形成的骨骼肌类器官缺少定向力学刺激和与之密不可分的高度有序的定向结构，因而更多的是模拟早期胚胎发育过程中的肌肉形成。