7.3 骨骼肌类器官的鉴定
骨骼肌中的肌纤维高度有序排列，通过肌腱与骨骼相连接，在运动神经元的支配下通过自主收缩带动骨骼产生运动。成功的骨骼肌类器官构建应当能够在体外部分或全部模拟上述骨骼肌的结构与功能。
骨骼肌类器官首先应当能够模拟体内肌纤维的高度有序排列。电镜观察分析表明，无论是使用自组织还是使用组织工程支架法构建的骨骼肌类器官，都或多或少获得了平行排列的肌纤维结构［10，11］。在2D培养中分化获得的肌管细胞成熟度较低，肌节（sarcomere）等一些重要的肌肉结构难以形成，一些重要蛋白如AChRE等没有表达，另一些重要功能蛋白如Dystrophin的细胞膜定位不准确。3D骨骼肌类器官通过施加电刺激、力学刺激、添加恰当的ECM成分、与神经元细胞或血管内皮细胞等共培养等方法，可有效地提高所获得的肌肉细胞的成熟度。应用多种方法制备的3D骨骼肌类器官在肌肉细胞的融合指数和肌纤维的直径等方面与2D培养相比均有显著提高，表明类器官中存在性能更优的单根肌纤维。3D培养的骨骼肌中肌纤维的排列更加有序，更接近体内骨骼肌的物理结构［29，30］。在体内骨骼肌通过与运动神经元细胞的轴突相互作用形成神经-肌肉接头，从而能够在运动神经元的支配下自主收缩。同时骨骼肌是高度富血管的组织，在骨骼肌中分布着大量的血管，为骨骼肌提供氧气和其他营养物质。血管化和神经化的骨骼肌类器官能够更好地模拟体内骨骼肌的功能和结构，促进骨骼肌细胞的成熟。构建具有神经-肌肉接头的神经化的肌肉类器官方面已经有一些研究发表。应用人多能干细胞在同一体外诱导系统中向神经前体细胞和肌肉细胞分化，通过自组织的方式能够形成具有神经-肌肉接头的类器官，部分模拟运动神经元在肌纤维上的投射［10，11，30，31］。在自组织形成的神经-肌肉类器官中，肌纤维的有序排列较体内肌肉组织为差，神经-肌肉接头存在于分散在类器官立体结构各处的肌纤维结构的界面上。应用生物材料制备的支架结合肌肉细胞和运动神经元细胞共培养构建的肌肉类器官，能够更好地模拟体内肌纤维的高度取向排列，及运动神经元投射至肌纤维上形成的具有特殊结构的神经-肌肉接头［11］。神经-肌肉接头的形成能够有效地促进肌纤维的成熟，提高单根肌纤维中细胞核的数量，增加肌纤维的直径。
神经-肌肉类器官还能进一步促进更多成熟神经-肌肉接头特异性基因的表达。例如，在体内成熟肌纤维能够在神经-肌肉接头的肌肉侧表达乙酰胆碱受体CHRNE。2D培养的肌肉细胞无法激活CHRNE的表达，而在3D培养的肌肉类器官中可以检测到明显的CHRNE表达，提示肌纤维的成熟度更高，更接近体内肌肉组织的基因表达情况［30］。此外，在3D肌肉类器官中，神经-肌肉接头的物理结构也更成熟，更接近体内性状，能够获得更多的具有分支和中空花冠状结构的成熟乙酰胆碱受体簇［23，30］。同时，乙酰胆碱受体与MuSK和Rapsyn等神经-肌肉接头蛋白的共定位也能够在肌肉类器官中得到很好的重现，而在2D神经-肌肉共培养系统中，几乎观察不到这类成熟的功能性神经-肌肉接头所特有的共定位［30］。
3D肌肉类器官不仅有利于神经-肌肉接头的形成和成熟，而且有利于肌纤维形成成熟的肌节结构。肌节是骨骼肌结构和功能的基本单位，由肌原蛋白（myosin）组成的粗肌丝和由肌动蛋白（actin）组成的细肌丝交错组织而成。两个肌动蛋白接头处形成Z线（Z line）。肌节即为在两条Z线之间的单元，这一单元反复重复，形成有功能的骨骼肌（图7-2）。在2D培养中很难形成规则完整的肌节结构，而在3D培养的类器官中可以观察到肌节的形成［30，32］。
图7-2 肌节结构示意图(https://www.daowen.com)
应用骨骼肌脱细胞基质或通过3D打印，引入脂肪间充质干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）、人血管内皮细胞（Hu VECs）等共同进行培养，能够形成具有一定血管化的类器官［23，33，34］。包裹在肌纤维束外面的肌膜既是肌肉高度有序结构的重要组成部分，同时也是肌肉干细胞的重要干细胞巢，为肌肉干细胞的干性保持提供物理微环境，在多种病理、生理过程中发挥重要的作用。应用肌肉来源的内皮细胞与人成肌细胞结合水凝胶，可以在体外构建具有血管和肌膜结构的肌肉类器官［35］。
与多数软组织不同，除了血管内皮、间充质细胞与运动神经元等多种细胞类型与肌肉细胞进行共培养，形成有机组织，促进类器官的成熟之外，电刺激、力学刺激等物理因素对肌肉类器官的成熟也发挥重要的促进作用。在类器官形成过程中施加电刺激，能够提高分化肌纤维的融合指数，增加融合细胞中细胞核的数量，Dystrophin蛋白可以正确定位在细胞膜上，表达肌节特异性α-actinin的细胞比例也显著提高［36］。通过固定锚点构建肌肉类器官可以模拟体内肌肉受到的力学刺激。力学刺激能够促进肌纤维的有序排列，提高肌纤维直径，促进肌节及神经-肌肉接头的形成与成熟［37］。
收缩能力是骨骼肌的重要性质，在肌肉类器官培养系统中，形成成熟神经-肌肉接头的3D肌肉组织具有更高的收缩频率和更强的收缩力，与之相对应，肌肉收缩所必需的钙流也相应增强［30，36］。通过电刺激模拟神经刺激，也能够提高3D肌肉组织的收缩频率、收缩力量和钙流［36］。
除了为机体提供运动所需的力量，支持主动运动外，骨骼肌还是体内最大的代谢器官，是进行糖代谢和脂代谢的主要场所之一。2D培养的肌肉细胞只能部分模拟体内骨骼肌的代谢，而3D培养的肌肉类器官能够较好地模拟体内肌肉的糖、脂和氨基酸代谢能力，其代谢流（metabolic flux）和底物使用情况都更接近体内肌肉［36］。
除了上述对肌纤维成熟度和肌肉功能的检测之外，单细胞测序也常用于检测类器官的细胞组成。特别是对于通过自组织方式形成的类器官，其组成细胞种类、比例等的变化对于类器官的功能有重要影响。稳定的构建方法能够每次获得细胞种类、比例较为稳定的类器官。对于这些指标的检查，单细胞测序目前发挥重要作用。
综上所述，人肌肉类器官在物理结构、纤维排列有序性、肌纤维成熟度、肌纤维收缩能力、钙流变化、神经-肌肉接头的完整性和成熟度等方面都更接近体内，但是目前还没有达到忠实完整模拟体内肌肉组织各方面性质的程度。因而不断改进类器官的种子细胞、生物材料的性能和构建方法，使在体外获得的类器官更接近体内骨骼肌的各方面性质是未来重要的努力方向。