9.2.2　诱导多能干细胞来源的乳腺类器官

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是利用分化的体细胞重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎多能细胞的一种细胞类型。2006年，日本的两位科学家Kazutoshi Takahashi和Shinya Yamanaka首次使用4种因子KLF4、Sox2、Oct3/4和c-Myc组合转入成人成纤维细胞诱导为iPSCs［23］。iPSCs具有向所有胚层分化的潜能，并在特定条件下可以形成各种类型的体细胞。大量文献报道，hiPSCs可以被诱导形成成熟的体细胞，如神经细胞、心肌细胞、肝细胞等；而且iPSCs分化形成的各种细胞在动物体内被证实能够模拟移植部位的器官功能。iPSCs技术、基因编辑和3D类器官技术相结合将极大推动iPSCs的应用。

近年来iPSCs诱导的技术不断得到改进，收集尿细胞是一个非侵入式获取体细胞的优选方法，在此基础上，中科院广州生物健康研究院裴端卿教授团队成功建立用尿细胞诱导成iPSCs的技术［24］。这种通过无创获取体细胞诱导iPSCs技术在临床上有非常明显的优势。不同细胞来源的乳腺类器官模型在构建方式上有所不同，在具体应用中也有一定差异。多种干细胞都可用于构建乳腺类器官，但是相比乳腺细胞系，干细胞在培养过程中需要增加诱导分化的步骤。2017年，美国西达-赛奈医疗中心崔晓江教授团队首次利用成纤维细胞以及血源性的hiPSCs进行体外诱导，并成功获得功能性乳腺类器官［16］。该类器官不仅具有类似正常乳腺的分支状结构，且表达乳腺腔上皮以及基底层上皮细胞标志物，包括雌激素受体、孕激素受体等［16］。功能性乳腺类器官同样具有泌乳功能，在催乳素刺激下能够分泌乳蛋白［16］。在此研究基础上，中科院昆明动物所陈策实教授团队首次将人包皮成纤维细胞（human foreskin fibroblast，HFF）添加到iPSCs诱导的乳腺样类器官模型中，发现HFF能够增加导管分支比和类器官直径，促进乳腺导管状结构的形成，HFF和乳腺样类器官共培养模型极大地提高了培养成功率［17］。

从人类胚胎乳腺发育的研究中得到启发，培养乳腺类器官一般被分为两个步骤：第一步是将iPSCs诱导分化为非神经外胚层，从而丰富乳腺祖细胞；第二步是模仿体内胚胎发育，以Matrigel和Collagen I的混合凝胶3D培养系统，添加刺激因子促进乳腺分化发育［16］。乳腺发育受到多种生长因子的调控。在小鼠模型中，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）/FGF受体、TBX3、NRG3/ERBB4和Wnt/LEF1信号通路参与调控乳腺早期发育［25，26］。此外，BMP4信号可能与甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein，p THr P）信号通路相互作用抑制毛囊发育，在早期胚胎乳腺发生和随后的乳腺发育中发挥重要作用［27］。体外研究表明，多种生长因子参与调控乳腺上皮细胞的生长、分化和成熟过程，如胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factors，IGF-1）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）［25］。

崔晓江教授团队建立了两步法乳腺类器官培养体系［16（］图9-3）。第一步，iPSCs具有多向分化潜能，在MammoCult培养基中添加肝素（heparin）和氢化可的松（hydrocortisone），在超低黏附培养皿中培养10天，可以获得含有乳腺干细胞的胚胎小体（MammoCult-derived embryoid body，m EB）。崔晓江教授团队确定了含有最大百分比非神经外胚层干细胞mEB培养的最佳时间点，即非神经外胚层分化的标志物（AP-2α、AP-2γ、P63、CK8和CK18）在10天m EB培养中高度诱导；相比之下，神经系统标志物（FOXG1、TUJ1、OTX2、SOX11和PAX6）、早期中胚层标志物（T/Brachyury和TGF-β1）和内胚层标志物（FOXA2和GATA4）表达减少、不变或轻度增加。此外，多能标志物（NANOG、OCT4和SOX2）的表达在10天mEB培养中显著降低；非磷酸化β-catenin和p-p65表达显著上调，表明Wnt和NF-κB信号通路的激活。m EB培养10天后进行转录组分析显示：上皮组织发育、腺体形成和乳腺生长信号通路显著富集，表明这一时间点的m EB在乳腺谱系分化方面具有最大的应用潜力。(https://www.daowen.com)

图9-3　hiPSCs体外两步诱导法构建乳腺类器官

第二步，将m EB包埋于Matrigel和Collagen I组成的混合凝胶3D培养系统后，加入含有p THrP的EpiCult B完全培养基培养5天；而后以添加了hydrocortisone、胰岛素（insulin）、FGF10以及HGF的EpiCult B完全培养基继续培养20～25天以获得乳腺导管分支和小叶腺体分化的类器官。超低黏附培养皿提供的漂浮混合凝胶培养系统促进了iPSCs衍生m EB向乳腺类器官的分化发育。乳腺类器官的腺泡样结构在3D悬浮培养的第10天开始出现，并且这种形态在第30天变得更加明显。为了进一步研究这些类器官是否属于乳腺谱系，利用IHC检测了广泛使用的乳腺标志物表达。崔晓江教授团队发现iPSCs诱导的乳腺类器官表达乳腺标志物（α-乳清蛋白和乳蛋白）、管腔上皮标志物（Ep CAM和CK18）和基底/肌上皮标志物（CK14和P63）［16］。p THrP对于乳腺腺泡的形成至关重要，在培养基中去除p THr P后，尽管m EB可以诱导乳腺标志物表达，但m EB不能形成乳腺腺泡结构［16］。

由于iPSCs可以从带有高危遗传突变的患者获得，这也使获得的iPSCs携带同样的遗传突变，为研究获得性基因突变在肿瘤易感性、发生和发展过程中的作用提供了理想的模型。大量研究已经针对由于遗传性基因突变引起的家族性癌症倾向综合征建立了iPSCs，如Li-Fraumeni综合征（Tp53突变）和具有乳腺癌倾向的BRCA1基因突变的iPSCs［28］。从Li-Fraumeni综合征患者获得的iPSCs显示出成骨细胞分化缺陷，并有癌变倾向，iPSCs基因表达谱分析结果表现为骨肉瘤原位癌的谱系特征，这也是该综合征患者常罹患的肿瘤类型［29］。