9.3.2　乳腺类器官能够保留复杂的乳腺上皮谱系

乳腺上皮细胞在类器官培养中能够形成不同的结构类型，其中大多数结构是腺泡型的，少部分乳腺类器官形成球形结构。乳腺腺泡能够嵌入Matrigel中逐渐延伸，形成分支结构；但随着反复传代，乳腺腺泡发育和导管延伸能力将逐渐减弱［19］。值得注意的是，类器官的反复解离和传代之后，细胞多样性也可以被很好地保留［19］。成熟乳腺上皮细胞在体外培养中主要产生具有空腔的乳腺腺泡，大部分细胞高表达Ep CAM；而基底/肌上皮细胞能够形成大的无序球体，具有更多样化的结构类型，表现出管腔出芽增殖或导管分支生长，并且能够分化为成熟的基底细胞、管腔祖细胞和成熟管腔细胞；管腔祖细胞则形成具有较小管腔的类球体，能够产生成熟的管腔和基底细胞［19］。尽管类器官形态结构和乳腺上皮谱系所占细胞比例可能不同，乳腺类器官一般都具有Ep CAM＋/CD49f-（成熟管腔细胞）、Ep CAM-/CD49f＋（基底/肌上皮细胞）和Ep CAM＋/CD49f＋（管腔祖细胞）3种细胞亚群［19］。值得注意的是，成熟乳腺上皮细胞能够形成乳腺类器官，但它们的整体类器官培养成功率低于乳腺干细胞。

乳腺导管-小叶系统的双层上皮结构是成熟乳腺类器官的典型形态特征之一。崔晓江教授建立的乳腺类器官培养体系中，可以观察到乳腺类器官腺泡结构由管腔上皮细胞（CK8＋）组成，周围环绕着一层薄薄的基底/肌上皮细胞（P63＋）［16］。利用IF发现乳腺类器官中存在与正常乳腺组织相似的3种细胞亚群，包括Ep CAM＋/CD49f-（成熟管腔细胞）、EpCAM-/CD49f＋（基底/肌上皮细胞）和EpCAM＋/CD49f＋（管腔祖细胞）多个细胞群［16］。在催乳素刺激下，乳腺类器官能够响应激素刺激分泌乳蛋白，这表明iPSCs可以被诱导分化形成具有泌乳能力的功能性乳腺类器官［16］。

乳腺类器官与乳腺组织特异性蛋白表达模式相似。类器官中的成熟管腔细胞维持了原代乳腺上皮细胞中特征性蛋白质表达（例如CK8、Muc1、Ep CAM、CD24和HER2）；ERα和PR在类器官中不同管腔上皮细胞的表达差异性较大，并且PR通常表达较低［19］。通过高表达CD133来鉴定管腔祖细胞。基底细胞高表达CD49f，并表达SMA、EGFR、CD90和CD10等特征性蛋白。在基底细胞中存在一小群细胞高表达PROCR，这群细胞高表达干性相关转录因子，其成球能力更强，这表明小鼠乳腺基底细胞中存在乳腺多能干细胞［19］。(https://www.daowen.com)

与正常乳腺上皮细胞系相比，乳腺类器官与原代乳腺组织来源的上皮表达特征的相关性很强，但也存在显著差异。乳腺微环境是由多种细胞（包括成纤维细胞和血管内皮细胞等）和ECM组成的复杂微环境，体外Matrigel培养或Matrigel和Collagen I混合培养并不能完全模拟复杂的体内微环境。由于基质细胞或先天组织结构缺失，部分乳腺类器官表现为CD10表达丢失。乳腺类器官相对于原代乳腺组织表现出更高水平的CD44表达，这可能是由于类器官培养基中的R-spondin 1诱导了CD44表达。与体内微环境相比，乳腺类器官管腔上皮细胞更加靠近基底膜类似物，增殖的成熟管腔细胞也会高表达通常由基底/肌上皮细胞产生的基底膜蛋白，例如层粘连蛋白332（Laminin 332）的γ2亚基［19］。

不同来源的乳腺类器官保留了患者的乳腺上皮谱系特征。大多数乳腺组织在作为乳腺类器官培养时会产生成熟的管腔上皮细胞、管腔祖细胞以及基底/肌上皮细胞。然而，不同患者来源的乳腺类器官间存在显著的异质性。BRCA1/2遗传突变的女性乳腺组织具有更高比例的管腔祖细胞，这种变化在乳腺肿瘤发生之前已经存在。与健康患者相比，利用BRCA1携带者正常乳腺组织培养的乳腺类器官中也有相似的管腔祖细胞比例增加，这可能反映了BRCA1乳腺上皮细胞的固有特性，与培养体系无关［19］。