10.4.1 人脑发育机制
通过上面的介绍，我们知道脑类器官可体外重现诸多人脑发育特征，因此是研究发育的合适模型。对于人脑相关研究，类器官技术的应用缓解了样本匮乏，或有限的脑组织样本难以用于精细的机制探究等挑战。另外，人源遗传背景的脑类器官，也可克服模式动物难以重现人类特异脑发育调控的问题。在过去的几年，脑类器官的应用在揭示人脑发育调控机制方面发挥了重要作用，下面我们将就相关代表性进展进行介绍。
图10-4 脑类器官的应用
1.神经前体细胞发育
人大脑皮层与其他物种尤其如啮齿类动物大脑相比，最典型的差异在于人脑皮层呈现大量扩增和折叠。该结构特征的建立，至少部分是源自前体细胞区域（如oSVZ区域）的扩增。近年来针对人脑组织的分析，包括大量单细胞水平的测序分析，揭示了人新生皮层oSVZ区域富集具备持续扩增能力的oRG，推测正是该类细胞的增殖行为驱动了人脑皮层的扩增。此外，研究表明oRG也存在异质性，从基因表达、细胞形态、对神经刺激的响应等方面，不同的oRG间存在差异。而除了皮层区域，对其他脑区的研究也揭示了o RG的产生，提示这类神经前体细胞对人脑不同区域的扩增发挥着普遍影响。
目前，关于人类特有的神经前体细胞如oRG的发育调控机制尚不明确，且难以用传统模型，尤其是模式动物进行模拟和分析。而我们上面提到，脑类器官从细胞组分、结构组织方面，均能重现oRG的基本发育特征，因此，该模型在过去几年很快成为人们分析oRG相关调控机制的重要工具。此外，目前在体外对干细胞或脑类器官的遗传操作也发展出了较多的技术手段，为验证特定基因的功能提供了便利。
比如，利用脑类器官技术，近年来研究人员针对人类特异基因ARHGAP11B在人新生皮层扩增中扮演的角色进行了探究。ARHGAP11B是最早被发现的可能与皮层扩增相关的基因之一，早期针对ARHGAP11B基因功能的研究，更多是在小鼠或非人灵长类动物（如狨猴）中过表达该基因，进而观察神经前体细胞增殖、皮层扩增等发育过程。这些探索表明ARHGAP11B的表达可增加神经前体细胞与神经元的数量，促进新生皮层扩增、折叠，乃至增强动物的认知能力。而除了这些间接的证据，如何在人脑发育过程中直接探究ARHGAP11B介导的皮层扩增调控机制？为了回答该问题，研究人员利用脑类器官模拟了人脑皮层发育，并通过不同的策略（如竞争性抑制蛋白功能、基因敲除）对ARHGAP11B基因功能进行干预［45］。结果显示ARHGAP11B基因功能缺失导致人脑类器官中增殖性神经前体细胞，尤其是oRG数量的降低。此外，在黑猩猩脑类器官中过表达ARHGAP11B基因，可将脑类器官中神经前体细胞，包括oRG的数量增加至接近人脑类器官的水平，这些工作直接证明了ARHGAP11B基因对于人脑皮层扩增的重要性，同时也为了解人脑进化机制提供了线索。
另外，一系列代表性的工作主要围绕TBC1D3基因开展。同样，关于该基因的研究不仅揭示了人脑发育调控机制，也与理解人脑进化密切相关（人脑发育调控机制与脑进化机制往往是密切相关的两个科学问题）。TBC1D3在人类基因组中以多拷贝形式存在，但在类人猿中仅含单一拷贝，在其他物种中更是不存在。若将TBC1D3基因在小鼠中表达，可显著增加小鼠新生皮层中的oRG细胞数量，并引发皮层折叠［46］。而如何在人脑发育背景下探究TBC1D3介导的皮层发育调控机制？一方面，研究人员可利用人脑切片培养进行分析；另一方面，为更便利、细致分析TBC1D3功能，研究人员利用脑类器官可重现神经前体细胞（包括oRG）发育行为的优势，开展了人源发育背景下的模拟与解析［47］。基于脑类器官的工作，进一步明确了TBC1D3通过与组蛋白甲基转移酶G9a互作，从而参与调控基因表达，促进人神经前体细胞增殖与皮层扩增的机制。(https://www.daowen.com)
此外，近年来的研究还发现，人类特异的NOTCH2旁系同源基因NOTCH2 NL在维持皮层神经前体细胞扩增中发挥着重要作用［48，49］。与真实人脑一样，皮质类器官发育过程中可表达NOTCH2NL基因，而NOTCH2NL的敲除则导致脑类器官提早进入更成熟的阶段。正是基于脑类器官的探索，研究人员证明了NOTCH2NL基因在维持人神经前体细胞特性、延迟神经分化中发挥着重要作用。
关于人脑发育调控，尤其是围绕人神经前体细胞如oRG的调控机制，目前尚有许多未知问题。包括针对我们上面提到的一系列关键基因，以及更多新发现基因及相关产物，它们具体是如何影响人类神经前体细胞增殖、分化等，也有待于进一步探索。而在近年来的研究中，我们可以注意到脑类器官技术已经开始发挥关键作用。当然，除了我们这里着重讨论的oRG等神经前体细胞行为，脑类器官也有望在展示其他脑发育环节的研究中展现其应用潜力。
2.脑区间、谱系间互作
脑类器官模拟发育，主要可利用单一的脑类器官模型，尤其是非定向分化脑类器官或皮质类器官。基于这些模型，可针对人皮层发育过程中前体细胞增殖、神经分化、胶质分化等环节的调控机制开展研究。当然，根据不同的研究兴趣，也可利用其他脑区特异类器官（如中脑类器官、小脑类器官等），探究更多的脑区特异发育调控机制。此外，我们在上面介绍复杂脑类器官构建时提到的多脑区类器官、多谱系类器官模型，也为模拟更多形式的复杂发育过程，如细胞迁移、环路连接、谱系互作等过程及机制，提供了便利的体外研究模型。
其中，细胞迁移是脑发育过程中最典型的细胞行为，包括相对局部的迁移，如皮层新生神经元沿着vRG或oRG的神经纤维迁移至皮质板区域，以及更多的跨脑区长距离迁移事件，如研究的最经典的抑制性中间神经元自端脑腹侧切向迁移至大脑皮层。对细胞迁移的调控研究，不仅始于深入认识人脑发育的需求，其对我们了解发育疾病及相关干预更是必不可少的一环。经典的探究中间神经元切向迁移的方案，主要包括对模式动物如小鼠胚胎脑的分析，或对人脑切片样本的分析。随着干细胞分化技术的日趋成熟，源自人多能干细胞的中间神经元分化产物，也开始被用于研究神经元迁移特性，比如将其与小鼠脑切片共培养，进而分析人源中间神经元在脑组织中的定向迁移行为。而如何完全在人源脑组织环境下，尤其是在3D发育环境下，研究人中间神经元的切向迁移，是大家尤为关注的问题。
针对该问题，近年来成功建立的最典型的方案，是利用脑区特异类器官精确重现特定脑区发育的属性，通过将其重新整合以重构不同脑区间的互作，即将单独分化的皮质类器官与腹侧端脑类器官进行融合培养，以促成腹侧端脑起源的中间神经元定向迁移至皮质区域［9-11］。利用该模型，人中间神经元在3D脑发育环境下的迁移特征得以被精细表征，包括中间神经元前导突起（leading process）的移动、细胞质拉伸、细胞核移动（nucleokinesis）等典型的细胞迁移特征，迁移后的人中间神经元也在皮层侧与兴奋性神经元建立功能性连接。既然可重现人中间神经元迁移过程，研究人员就有了更便利的模型来在体外探究中间神经元迁移调控因子。比如，对趋化因子受体CXCR4的抑制，或对非肌型肌球蛋白Ⅱ的抑制，均可显著降低中间神经元的迁移，证明其在人中间神经元切向迁移过程中发挥着不可或缺的功能。而进一步的研究还可基于该模型更系统地筛选（包括组学筛选）人类中间神经元迁移调控因子，或解析特定发育疾病背景下中间神经元异常迁移机制。因此，在非定向分化脑类器官、多种脑区特异类器官的基础上，复杂多脑区类器官的构建又为模拟人脑发育调控提供了一种全新的策略。
利用类似的策略，研究人员近年来建立了更多的脑类器官组装体模型，以模拟其他形式的复杂发育过程，如脑区间环路发育、不同胚层谱系来源细胞互作等。相关的互作脑区主要涉及皮质与丘脑、皮质与纹状体、皮质与脊髓等。这些组装体中可呈现神经元轴突的靶向性投射，并与靶组织形成功能性神经突触连接，从而为体外模拟不同脑区间的神经环路发育提供了基础。涉及多谱系互作，目前主要关注的重点包括脑血管、血脑屏障、免疫细胞、胶质细胞等与脑神经组织间的互作模拟。比如，脑血管的引入将增强脑类器官中养分和气体的交换，同时补充了脑发育过程中来自血管组织的调控因子，为研究神经—血管互作调控提供了模型。作为脑发育调控中必不可少的组分，不同的谱系间互作的重现为审视人脑发育中多种共发育、互调控过程，提供了与传统细胞培养相比更具生理相关性的3D模型。此外，由于以上这些生物学过程与功能的异常常与不同类型的疾病相关，除了用于探究正常生理环境下脑发育、脑功能调控机制，不同的复杂脑类器官组装体也将在疾病研究方面拥有广阔的应用前景。