10.3.3　脑类器官的功能

神经元的功能成熟一般需要较长时间，同时，该过程也依赖于多种神经谱系间的紧密联系，这一方面是指不同神经元间需建立功能连接，另一方面也指神经元与胶质细胞间的互作。为满足该需求，2D分化研究中，常采用将不同的神经元共培养，或将神经元与星型胶质细胞共培养，以促进神经元功能成熟。但即便如此，2D培养仍面临较大的局限性，其中最典型的问题是难以实现长时间（如两个月以上）的培养，因而限制了复杂神经网络的构建。

与传统2D培养相比，脑类器官为神经元功能发育提供了更适宜的生理环境，这其中包括更具异质性的细胞组分（如不同的神经元、胶质细胞），与体内更为接近的3D环境，以及长达数月甚至一年以上的培养时间窗口。在此条件下，脑类器官中的神经元可实现更好的功能成熟。下面，我们将从突触与环路两方面介绍脑类器官的功能。

1.突触发育

神经突触是神经元间传递信息的结构基础，也是复杂神经环路形成的结构基础。与单层培养时突触发育只能在2D表面进行不同，脑类器官中的神经元及其他细胞呈现更复杂的3D形态，因而更有利于突触发育。通常体外培养的脑类器官，在1.5～2个月时，可检测到神经元间的突触连接。检测的方式，可采用针对突触前［比如突触素I（synapsin I，SYN1）、囊注GABA转运体（vesicular GABA transporter，v GAT）］、突触后结构特异蛋白［比如突触后密度蛋白95V（postsynaptic density protein 95V，PSD95）、桥尾蛋白（gephyrin）］的免疫荧光染色，或通过透射电镜更精确地分析突触结构。在更长期的培养过程中（如3个月及以上），脑类器官中将检测到更密集的突触结构。当然，突触的类型取决于脑类器官的类型。比如，非定向分化脑类器官、皮质类器官中主要富集兴奋性神经突触，而腹侧端脑类器官中主要富集抑制性神经突触。体现在功能上，培养约3个月左右的脑类器官中，可通过对急性切片的膜片钳记录，检测到神经元动作电位发放、突触后电流等特征。

除了3D神经元网络促成了突触发生，我们上面提到的其他细胞比如胶质细胞，也在其中发挥了关键作用。星型胶质细胞在脑类器官中的产生晚于新生神经元的产生，在其产生后，将与神经元发生结构、功能上的密切互作。少突胶质细胞一般难以在脑类器官中自发产生，而通过特定诱导生成的少突胶质细胞，也可对神经元轴突形成髓鞘化，从而促进神经元功能成熟［42，43］。因此，脑类器官不仅限于研究神经元功能发育，对于解析人脑发育中胶质细胞功能、神经元—胶质细胞互作等，也同样扮演着重要角色。(https://www.daowen.com)

2.神经环路

除了上面提到的对脑类器官切片的单细胞膜片钳实验，还可通过更简便的方式对脑类器官功能进行判断，比如钙成像、多电极阵列（multi-electrode array，MEA）等分析。在展示单个神经元功能的基础上，钙成像、MEA等分析往往还可揭示潜在的功能性神经元网络的形成。比如，通过对脑类器官解离样本、或对完整3D脑类器官的钙成像，可观察同步放电网络是否形成。此外，基于脑类器官切片的长距离电刺激与记录实验，也可明确脑类器官中是否形成了功能性神经网络。通常在长时间培养后（比如3个月以上），脑类器官中可形成功能性神经元网络。在培养近10个月左右后，脑类器官中甚至可检测到类似产前脑电图的复杂神经元网络活性［44］。

当然，虽然与2D培养相比，脑类器官为神经元网络发育提供了更优条件，其中的神经元网络仍难以等同于体内的神经环路。比如，皮质类器官中虽然可建立复杂功能性神经元网络，但仍不能等同于大脑皮层不同区域间的靶向性投射连接。因此，如何更精确构建神经环路仍是目前需解决的技术难题。我们上面提到的多脑区类器官组装体，是攻克该技术难题的策略之一，目前基于该策略，研究人员已可在体外重现脑区间（比如皮层与丘脑、皮层与纹状体、皮层与脊髓等）环路连接的基本特征，为模拟相关区域间连接、调控及疾病机制提供了新的可选方案。

此外，除了经典的膜片钳、钙成像检测，以及近年来开始广泛应用的MEA分析，更多的功能检测方案也被应用于脑类器官研究中。其中比较有代表性的是柔性电极与脑类器官的整合。该技术的应用，将便于对脑类器官中神经元功能的持续性检测，甚至实现对脑类器官发育的多模态刺激调控。不同神经元功能研究技术的应用，将促进进一步明确脑类器官发育特征，以及优化脑类器官培养方案。