13.2.1　小鼠类胚胎的构建

小鼠多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）、胚外干细胞和超潜能干细胞（expanded potential stem cells，EPSCs）［53，54］的建立，为类胚胎的构建奠定了基础。小鼠多能干细胞包括naive状态的小鼠胚胎细胞（embryonic stem cells，ESCs）［55］和小鼠诱导多能细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）［56］，以及primed状态的小鼠表皮细胞（epiblast stem cells，EPiSCs）［57，58］。小鼠胚外干细胞包括滋养层干细胞（trophoblast stem cells，TSCs）［59］和XEN细胞［60］。目前，对小鼠类胚胎的构建研究较多，进展也较快。根据类胚胎的生长方式、细胞组成、形态特征和发育潜能，已建立的小鼠类胚胎主要包括：拟胚体（embryoid bodies）［61］、微图案集落（micropatterned colonies）［62］、原肠体（gastruloids）［63］、躯干样结构（trunk-like structures）［64］、类囊胚（blastoid）、ETS胚体（ESC-and TSC-derived embryoid，ETS embryoid）和ETX胚体（‘ES+TS+XEN’derived embryoid，ETX embryoid）（图13-1）。

图13-1　小鼠和人的类胚胎研究进展（在Jianping Fu等［7］的基础上进行修改）

拟胚体、微图案集落和原肠体都来自单一细胞类型（小鼠PSCs），主要模拟胚胎原肠发育和三胚层特化；躯干样结构是通过改善原肠体的培养条件所获得的一种新的原肠体。相对于人而言，小鼠拟胚体和微图案集落的研究相对较少，这两种模型将在“人的类胚胎构建”部分进行详细介绍。2018年，Alfonso Martinez Arias团队发现将小鼠ESCs悬浮培养形成的聚合物，在体外给予刺激后可以延长和形成原肠胚样结构，在时空上模拟三胚层的发生和基因表达，同时证明了小鼠ESCs的自组装能力［63］。该团队利用单细胞RNA测序和空间转录组测序技术，进一步揭示了原肠体中体节发生时的基因时空表达谱［65］。但是，Alfonso Martinez Arias团队报道的原肠体没有模拟原肠阶段的一些形态发生事件，如体节和神经管的形成。因为胞外基质在组织形态发生中具有关键作用［66，67］，2020年，Bernhard G.Herrmann团队将第4天的原肠体转移到5% Matrigel中，继续培养24 h后获得了躯干样结构，这种新的结构产生了前后轴、神经管、体节等原肠阶段的形态结构［64］。上述原肠体模拟的是原肠胚早期的三胚层细胞形成。最近，小鼠ESCs形成的原肠体可以进一步产生心血管祖细胞和血管样结构，心脏祖细胞自发组织成新月形和心管样搏动区［68］。徐鹏飞团队利用多细胞团（作为形态发生信号中心，即充当“组织者”）融合的方法，给予小鼠胚胎干细胞团以形态素BMP的浓度梯度，诱导具有与小鼠神经胚阶段胚胎高度相似的小鼠类胚胎［69］。该类胚胎发育生成神经管、脊索，体节，自主搏动的类心脏组织并形成血管网络系统；在腹部，类胚胎分化出一个原始的肠管，其前后和背腹图式均被很好地诱导。

上述小鼠的类胚胎均属于非整合胚体，缺乏胚外组织，不能模拟胚胎和胚外组织的相互作用。当前，解决胚外组织缺乏的问题，主要有两种途径。(https://www.daowen.com)

1.重构类囊胚

近年来，用小鼠干细胞重构类囊胚取得了巨大突破。2018年，荷兰马斯特里赫特大学的Nicolas C.Rivron团队，首次用小鼠ESCs和小鼠TSCs在体外构建出类似小鼠E3.5的囊胚样结构，称为类囊胚［70］。小鼠类囊胚构建过程中，位于内部的胚胎细胞（ICM样细胞）分泌信号驱动外部的滋养层细胞发育进而诱发类囊胚的形成。对类囊胚与真实囊胚的转录因子进行分析，发现类囊胚与真实囊胚非常相似。而且通过类囊胚，可以成功分离到对应囊胚3种细胞谱系的小鼠ESCs、小鼠TSCs和小鼠XEN细胞。通过类囊胚，研究人员揭示了来自胚胎细胞分泌的Nodal和BMP信号对滋养外胚层的生长和发育至关重要。鉴于该类囊胚的原始内胚层（primitive endoderm，Pr E）生成效率很低，为此，Nicolas C.Rivron团队在之前的基础上进行了优化，提高了类囊胚产生Pr E的能力并使其与真实胚胎更相近［71］。在Nicolas C.Rivron团队的基础上，2019年，美国索尔克生物学研究所的Juan Carlos Izpisua Belmonte团队构建了一种新的培养体系，其能够直接通过小鼠EPSCs（不使用小鼠TSCs）在体外构建出小鼠类囊胚［72］。随后，Magdalena Zernicka-Goetz团队将小鼠EPSCs与小鼠TSCs混合，也成功获得类囊胚，而且和前面两个团队的工作相比，Magdalena Zernicka-Goetz团队建立的类囊胚的形成效率更高，发育潜能也更好，在体外延长培养过程中，能形成典型的卵圆桶结构［73］。然而，当被移植到假孕鼠子宫时，上述类囊胚虽能着床并诱发蜕膜反应，但不能像真实胚胎一样进一步往下发育产生胎儿和完整的胚外组织。2022年，Yasuhide Ohinata等建立了比小鼠XEN细胞具有更好发育潜能的Pr ECs，该团队联合小鼠ESCs、小鼠TSCs和小鼠Pr ECs重构小鼠类囊胚并移植到假孕鼠子宫。尽管发现新方法建立的类囊胚在体内能够产生更好的卵黄囊样结构，但依然不能产生胎儿和完整的胚外组织［74］。上述结果表明，小鼠类囊胚和真实囊胚相比，其发育潜能仍然存在很大缺陷，具体的机制还有待进一步的探索。

2.组装ETS和ETX胚体

2017年，Magdalena Zernicka-Goetz团队用小鼠ESCs和小鼠TSCs进行组装，借助Matrigel提供的胞外基质首次在体外实现小鼠胚胎样结构的组装（称为ETS胚体）。小鼠ETS胚体与真实胚胎的形态、结构和细胞组成非常相似，且能够像真实胚胎一样，在滋养层和上胚层的交汇处自发实现对称打破，产生中胚层并起始PGCs的特化［75］。但ETS胚体不能发生上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和前后轴特化，因而不能正常起始原肠运动。为了改善ETS胚体的发育缺陷，Magdalena Zernicka-Goetz团队［76］和中国农业大学的韩建永团队［77］，先后在ETS胚体的基础上加入小鼠XEN细胞，从而获得了一种新的胚胎样结构，称作ETX（小鼠ES细胞+小鼠TS细胞+小鼠XEN细胞）胚体。相比ETS胚体，ETX胚体与真实胚胎更类似，且能够发生EMT、前后轴特化进而启动原肠。当移植到假孕鼠子宫，ETX胚体能够启动着床并触发蜕膜反应。但遗憾的是，ETX胚体并不能进一步发育产生胎儿和完整的胚外组织。考虑到小鼠XEN细胞只有有限的发育潜能，不能完整模拟原始内胚层的发育［78］，因此，在ETX胚体构建过程中，使用发育上处于更早时期的小鼠Pr ECs［74］代替小鼠XEN细胞或许能够进一步提高ETX胚体的发育潜能。当过表达转录因子Gata4或Gata6时，小鼠ESCs能被诱导分化为小鼠XEN细胞［79］。2021年，Magdalena Zernicka-Goetz团队在小鼠ESCs和小鼠TSCs的基础上，用过表达Gata4的小鼠ESCs代替小鼠XEN细胞，构建出一种新的ETX胚体，称为诱导ETX（inducible ETX，iETX）胚体［80］。同ETX胚体相比，iETX胚体展现更好的发育潜能，培养到第6天的iETX胚体，其结构特征类似E7.5小鼠胚胎［80］。研究人员通过改进培养体系，进一步将iETX胚体在体外培养到第8天，并很好地模拟了E8.5前的小鼠胚胎发育。除了绒毛和卵黄囊等胚外组织，iETX胚体还很好地模拟了原肠运动，神经发育和早期器官发生，包括整个脑区、跳动的心脏、躯干结构（神经管和体节）和尾芽（神经中胚层祖细胞、肠管和原始生殖细胞）的形成［81］。几乎在同一时间，Jacob H.Hanna团队和Magdalena Zernicka-Goetz团队在上述iETX胚体的基础上，进一步使用过表达Cdx2的小鼠ES细胞替代小鼠TS细胞（即3种小鼠ESCs进行组装：野生型小鼠ESCs+过表达Gata4的小鼠ESCs+过表达Cdx2的小鼠ESCs），这种新建立的iETX胚体也能在体外培养到第8天，并且比较完整地模拟了E8.5前的小鼠胚胎和胚外组织的发育［82，83］。