13.2.2　人的类胚胎构建

hPSCs［84，85］和hEPSCs（human expanded potential stem cells）［86，87］的建立，为类胚胎的构建奠定了基础。h PSCs包括h ESCs（human embryonic stem cells）［84］和hiPSCs（human induced pluripotent stem cells）［85］，主要包括始发态、活化态和原始态3种状态（活化态还有待进一步验证）［88］。与小鼠相比，用人干细胞构建类胚胎的相关研究处于滞后状态。当前，已建立的人的类胚胎主要包括：拟胚体［89］、微图案集落［90］、原肠体［91］、连续体节样结构（sequential somite-like structures，也被称作Axioloids［92］或Segmentoids［93］）、羊膜囊胚体（amniotic sac embryoid）［94-96］、不对称上胚层模型（asymmetric epiblast model）［97，98］和类囊胚［99-105（］图13-1）。这些类胚胎中，拟胚体、微图案集落、原肠体、连续体节样结构、羊膜囊胚体和不对称上胚层模型均来源于始发态hPSCs，且这些模型都属于非整合胚体。相反，类囊胚来源于原始态h PSCs、h EPSCs、重编程的体细胞或始发态到原始态的中间过渡态细胞。

1998年，Thomson实验室建立了始发态h ESCs的体外培养体系。不久后（2000年），Itskovitz-Eldor等用拟胚体的方法证实了始发态h ESCs的三胚层分化潜能。过去20年左右的时间，拟胚体已被广泛用于研究人胚胎早期发育和三胚层特化。然而，该模型通常呈现一团无序的细胞结构，三胚层分化错乱而不均质，缺乏胚胎发育的时空特异性［106-108］，因此，拟胚体的方法已被逐渐淘汰。微图案（micropattern）是采用物理或化学的方法创造特定的图案和纹理表面，2014年，Warmflash等将微图案与始发态hPSCs分化相结合，开启了2D条件下对人原肠发育和三胚层特化的精确研究［90］。相对于拟胚体，微图案法能够获得规则的、具有层次结构的胚层分化，非常适合量化研究。比如，BMP4处理能诱导生长在微图案里的h ESCs集落从最外圈到中心依次有序地分化为滋养层或羊膜样细胞、内胚层、中胚层和外胚层［90，109-111］。这种由不同胚层有序排列成同心圆的微图案集落也被称为2D原肠模型［7］，然而，2D原肠模型缺乏体内胚胎的3D结构，不能模拟真实的胚胎发育。2020年，Naomi Moris等将WNT激动剂（CHIR99021）短暂处理的始发态h PSCs接种至低吸附培养板里聚集成细胞团，培养过程中，这些细胞团自发地拉长为尾芽状结构（tail-bud-like structures）的原肠体［91］。3D悬浮的原肠体能模拟着床后胚胎经历的部分前后轴特化的发育事件（如同源盒基因的表达），但可能因为WNT信号对前轴神经特化的抑制效应，原肠体没有形成前端的神经结构［91］。此外，3D原肠体的制备过程中，不同细胞系对CHIR99021的浓度及其处理时间具有不同的响应，因此，3D原肠体缺乏微图案集落拥有的良好可控性和可重复性［90，91，109-111］。最近，通过瞬时调节信号通路（WNT/FGF/TGFβ或WNT/BMP）和改进培养体系（添加10%Matrigel），Olivier Pourquié团队和Cantas Alev团队分别在原肠体制备的基础上，用始发态hPSCs构建出体节发育（somitogenesis）模型，即连续体节样结构，该模型能在体外很好地再现分节时钟（segmentation clock）的振荡动态，以及连续体节形成的形态结构和分子特征［92，93］。这两个研究首次用干细胞，在体外重建出人胚胎发育过程中最早出现的重复性解剖单元或节段（segment）——体节，为后续体外解码体节发生的生物学过程以及先天性脊柱畸形的致病机理奠定重要基础。

随着胚胎着床，上胚层细胞开始极化并形成玫瑰花环样结构，进而经历腔的发生并形成羊膜腔结构——靠近滋养层的一侧形成鳞状上皮并下调多能性标志物NANOG和SOX2的表达，而与下胚层相连的一侧继续维持柱状上皮并保持多能性［112］。无论拟胚体、微图案集落还是原肠体，都不能模拟羊膜腔的特化。细胞外基质的使用，修改了腔形成的细胞凋亡学说：是细胞外基质，而非之前公认的细胞凋亡驱动围着床阶段上胚层细胞的自我极化和腔的形成［26，28，49，113，114］，这开创了羊膜腔特化的体外研究。当被培养在3D胞外基质中，hPSCs便会像围着床期的上胚层，自发极化和形成腔样结构［28，114］。此外，以内源性BMP信号依赖的方式，生长在软的胞外基质表面的始发态hPSCs会自发生成鳞状羊膜样球体［94］，在此过程中，机械硬度和细胞密度扮演着关键角色：硬表面和高细胞密度维持多能性并抑制羊膜特化；相反，软表面和低细胞密度促进羊膜分化［94，95］。在鳞状羊膜样球体的生成过程中，有5%～10%的结构没有完全特化为羊膜，而是自发地打破对称形成一个双极结构——一端为柱状多能细胞，而另一端为鳞状羊膜细胞，类似原肠前胚胎中上胚层和羊膜上皮共同构成的双极胚盘［7，95］。为了实现双极胚盘模型的重复性和可控性，2019年，Yi Zheng等开发了一种微流控装置，高效地产生羊膜囊胚体（双极胚盘样结构），并进一步揭示了羊膜上皮样细胞在诱发人原肠样事件中的作用［96］；此外，该模型还进一步帮助绘制了人羊膜细胞、原始生殖细胞和原条细胞的发育轨迹，并阐明了Nodal信号在中胚层和原始生殖细胞特化中的关键角色［115］。然而，随着往下培养，羊膜囊胚体中的上胚层样细胞一侧，不是完全分化为后端组织，就是完全特化为前端结构，不能像真实胚胎一样形成前后轴对称打破的发育模式［7，96］。上胚层的前后轴对称打破，标志着原肠运动的起始［21］。2019年，Mijo Simunovic等将始发态h PSCs消化为单细胞后接种到Matrigel和水凝胶混合的胶床上，在低剂量BMP4（1 ng/ml）的诱导下，始发态hPSCs以3D细胞球的方式生长、自发极化并以WNT-DKK1依赖的方式模拟上胚层发育过程中的前后轴对称打破［97］。2022年，Mijo Simunovic等进一步用始发态hPSCs来源的胚外细胞（一群由滋养层、羊膜和胚外中胚层样细胞组成的混合细胞），包裹并诱导始发态hPSCs发生自发的前后轴对称打破［98］。Mijo Simunovic等的研究表明，胚外细胞分泌的BMP信号在人上胚层前后轴对称打破上扮演关键作用。(https://www.daowen.com)

上述提到的拟胚体、微图案集落、原肠体、羊膜囊胚体和不对称上胚层模型，均只模拟了着床后上胚层的一些发育事件，但由于不含胚外组织，并不能用于揭示完整胚胎的发育机制。2021年，两个研究小组同时报道产生类囊胚——Leqian Yu等诱导原始态hPSCs自我组装为类囊胚［101］，Xiaodong Liu等重编程体细胞产生类囊胚［104］。类囊胚在形态结构上与真实囊胚相似，然而，这些囊胚样结构携带大量真实囊胚中不存在的中胚层样细胞和未定义的细胞类型，以及着床后胚胎中才包含的一些细胞类型［101，104，116-118］。此外，Xiaodong Liu等重编程体细胞产生的类囊胚中的滋养层样细胞，其基因表达谱更类似羊膜细胞而非囊胚滋养外胚层［104，117］。不久后，Berna Sozen等和Yong Fan等也报道使用h EPSCs［86］成功构建了类囊胚［102，103］，然而，这些h EPSCs来源的类囊胚在组织结构和细胞组成上和真实囊胚相差较大。鉴于h EPSCs和着床后上胚层细胞具有相似的转录和表观特征［119123］，因此，相比h EPSCs，对应着床前上胚层的naive hPSCs可能更适合用来重构类囊胚。不同于始发态hPSCs和hEPSCs，原始态hPSCs在TGF-β和ERK信号双抑制的条件下快速分化为滋养层细胞［119，120］，基于此，Ayaka Yanagida等对TGF-β和ERK信号进行双抑制，诱导原始态hPSCs在3天内产生类囊胚［100］，其诱导速度远快于之前报道的方法［101104］。因为抑制Hippo信号促进桑椹胚外围的细胞特化为滋养外胚层［124］，2021年底，Harunobu Kagawa等在对TGF-β和ERK信号进行双抑制的基础上，通过进一步抑制Hippo信号，建立了一个更高效的方法将原始态h PSCs在4天内诱导为类囊胚［99］。上述两个新方法重构产生的类囊胚［99，100］，都包含了囊胚阶段对应的3种基础细胞——滋养外胚层、上胚层和下胚层，并且在细胞组成和单细胞转录组方面比之前建立的类囊胚［101-104］与真实囊胚更相似。用新建的类囊胚体系，Harunobu Kagawa等进一步揭示了上胚层样细胞诱导与之相邻的极性滋养层样细胞成熟，进而使其获得黏附受刺激的子宫内膜细胞的能力，一定程度上模拟了囊胚着床的细胞互作机制［99］。最近，Zhifen Tu等发现始发态到原始态的中间过渡态细胞中包含囊胚阶段的3种基础细胞，并用这些中间态细胞成功构建了人的类囊胚［105］。然而，不同于小鼠类囊胚［70，71，73］，而是和其他方法产生的人的类囊胚［101-104］相似，最近3种新方法建立的类囊胚也显示比较有限的着床后发育潜能［99，100，105］，表明当前建立的人的类囊胚还存在一些未知的缺陷。我们猜测，可能有三方面的原因对人的类囊胚的发育潜能造成影响：①脱靶细胞，当前建立的人的类囊胚，都含有或多或少的脱靶细胞［99，117，118］；②与真实囊胚相比，类囊胚中的上胚层样细胞具有高得多的细胞占比［117］；③已有研究表明，大多数非整倍体人胚胎的着床后发育潜能有限［125］，而用于制备类囊胚的原始态hPSCs，存在普遍的印记基因异常和染色体畸变［126-129］。

综上，当前人的类囊胚制备技术，尚处于起步阶段，还有很多技术瓶颈需要突破。