14.2.2　肿瘤类器官的构建

利用肿瘤组织构建类器官通常包括以下几个步骤：①使用手术刀切碎组织块；②用胶原酶、脱氧核糖核酸酶、中性蛋白酶、透明质酸酶、胰蛋白酶（或Tryp LE）、酶混合物如Liberase（胶原酶Ⅰ、Ⅱ和热溶酶的混合物）等将切碎的肿瘤组织块消化成单细胞悬液或细胞团，注意在消化过程中定期检查肿瘤组织块消化程度；③将消化后的细胞团用含青/链霉素的预冷PBS反复清洗，后离心去上清，将细胞沉淀用基质胶重悬；④加入合适培养基，在37°C和5%CO2的细胞培养箱中培养。在构建不同癌种的PDO的过程中，使用的酶的类型及其浓度、消化时间、细胞团大小、基质胶、种板密度和培养基等方面均存在差异。

利用循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）构建PDO首先需要从患者血液中富集CTCs，较为常用的富集方法是阴性富集法（免疫磁性分离）和过滤法［31］。阴性富集法是指利用CD45磁珠抗体偶联的磁珠吸附去除CD45+的白细胞，间接筛选出全部类型的CTCs。过滤法则利用CTCs的物理特性，即细胞大小，将患者外周血加入过滤器中，离心收集CTCs。将富集的CTCs加入基质胶内并种板，后续处理方式与肿瘤组织来源的类器官基本相同［32］。(https://www.daowen.com)

肿瘤类器官完全培养基大多使用DMEM/F12作为基本培养基来制备，但不同肿瘤类器官所需的诱导因子不尽相同，其中大多包含酪氨酸受体激酶的配体、Wnt信号通路激活剂、TGF-β信号通路抑制剂等。在第二次传代前，最好在培养基中添加10μM Y-27632。每2～3天更换一次培养基，以确保培养基中有足够的因子。培养基中需添加足量的青霉素和链霉素。对于从结肠、口腔黏膜等污染区域采集的样本，建议额外添加其他的抗生素，如Primocin、万古霉素等。在种板后的前几天应密切监测类器官的状态，以防止潜在的细菌或真菌感染。如发现污染，应立即加入NaOH等消毒剂清除污染类器官，并清洗培养皿和更换培养皿盖。此外，还应定期检查类器官是否有支原体污染。