14.5.1 肿瘤类器官应用
肿瘤类器官作为近10年来新兴的肿瘤模型，在各种恶性肿瘤的基础研究和转化研究中发挥着越来越重要的作用。接下来，本节将从绘制肿瘤基因突变谱及多组学谱、药物靶点筛选、研究肿瘤异质性和肿瘤进化、肿瘤微环境的研究、肿瘤耐药机制的探索、前瞻性指导肿瘤患者治疗等6个方面详细描述肿瘤类器官的应用领域。
1.绘制肿瘤基因突变谱及多组学谱
多项肿瘤类器官研究在建立肿瘤类器官生物库后应用全基因组或者全外显子测序的方式全面描述了肿瘤类器官的常见基因突变谱，结果显示肿瘤类器官能够较好保留原位肿瘤的基因组改变，包括拷贝数变异和基因突变情况。复旦大学章真和华国强团队建立了局部进展期直肠癌类器官生物库，并通过将肿瘤类器官及对应患者的直肠癌组织进行全外显子测序，结果显示直肠癌类器官与直肠癌组织的基因突变情况高度一致［18］。Joshua Smith团队建立的65例直肠癌类器官生物库，并对其中31例直肠癌类器官与原位肿瘤组织进行全基因组测序，结果显示直肠癌类器官致癌突变与原位直肠癌组织一致性为在90%以上［17］。
多项研究也针对罕见肿瘤类器官进行多组学测序和多组学谱的描述，如Toshiro Sato团队建立25例胃肠道胰腺内分泌肿瘤的罕见肿瘤类器官库，并且对原位肿瘤组织和肿瘤类器官进行全基因组测序/甲基化微阵列分析、转录组测序及ATAC-seq，详细描述了消化道内分泌肿瘤的突变谱及转录组情况，并发现通过敲除TP53和RB基因，再加上6个相关转录因子的过表达，能够将正常消化道类器官转变成神经内分泌肿瘤类器官［21］。
此外，肿瘤类器官结合蛋白组学、单细胞组学探索肿瘤发生发展机制的研究也越来越多。其中，对肿瘤类器官进行单细胞转录组测序能够研究肿瘤异质性及肿瘤进化，当然，单纯肿瘤类器官培养缺乏肿瘤间质和免疫成分，一定程度限制了其在单细胞测序中的应用。肿瘤类器官作为能够预测患者疗效及模拟临床耐药的体外模型，能够多次传代并且扩增冻存，在无法获得临床样本或样本大小有限时，提供了较好的测序样本。多组学测序与肿瘤类器官技术的结合不仅能够描述多组学谱特征，还能帮助建立新的分子分型及寻找新的药物靶点。
2.患者疗效预测及药物靶点筛选
患者来源肿瘤类器官能够较好保留肿瘤患者原位肿瘤的基因组改变、转录组特征、分子特征以及对放化疗、靶向治疗及免疫治疗的敏感性，因此多项研究应用肿瘤类器官预测患者疗效和筛选药物靶点。
患者来源肿瘤类器官能够帮助在体外对患者肿瘤组织进行药物敏感性测试，可对患者临床已有治疗的疗效预测并且回顾性评价，亦可应用肿瘤类器官对患者目前未行治疗方案进行预测。复旦大学章真和华国强团队发现直肠癌类器官预测患者新辅助疗效的准确性为84%［18］，该团队后续研究发现，直肠癌类器官对伊立替康敏感性能够较好预测局部进展期直肠癌患者完全缓解状态及预后［102］。Joshua Smith团队研究发现肠癌类器官对5-FU和FOLFOX敏感性与患者的无进展生存（progression-free survival，PFS）相关；类器官水平对X射线的敏感性与患者接受放疗前后内镜下的肿瘤退缩程度相关［17］。Hans Clevers团队建立了22例结直肠癌类器官生物库，并将肿瘤类器官应用于83个化合物的敏感性筛选，包括已在临床使用的药物（n＝25）、化疗药物（n＝10）、此前研究过的药物或目前正在临床试验中的药物（n＝29），以及处于基础实验中的抗肿瘤化合物（n＝29）［6］。
以上研究都是回顾性研究或者与临床并行的类器官转化性研究。目前肿瘤类器官药物敏感性前瞻性指导患者治疗方案选择的临床试验数目有限，大多处于患者招募状态。Emile Voest团队的SENSOR研究是一项根据肠癌类器官敏感性前瞻性干预患者治疗的临床试验，但该研究的阴性结果表明应用肠癌类器官药物敏感性为多线治疗失败的转移性肠癌患者选择靶向治疗无法使患者取得预期疗效［50］。Susan Woods团队的研究首先建立了结直肠癌腹膜转移类器官库，并通过全外显子测序和类器官药物敏感性结果给出患者临床治疗方案建议，结果显示1例患者腹部肿瘤病灶治疗后较前退缩［103］。
目前肿瘤类器官单一模型前瞻性指导患者临床治疗的能力比较有限，并且受限于肿瘤类器官培养成功率不高及药敏时间较长等条件，还需要进一步优化肿瘤类器官提取及药敏体系以达到前瞻性指导的目的。除此之外，还有多项肿瘤类器官联合循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ct DNA）、影像组学等因素前瞻性指导患者个体化治疗的临床研究正在患者招募中，期待这些研究为肿瘤类器官前瞻性指导个体化治疗奠定基础。
肿瘤类器官在基础研究中还能被应用于新靶点的寻找和验证。例如肿瘤类器官进行多组学测序或CRISPR-Cas9文库筛选等方式联合患者临床疗效，可帮助寻找耐药靶点并验证耐药靶点药物敏感性。此外，在应用肿瘤细胞系或其他肿瘤模型测序寻找到相应靶点后，肿瘤类器官作为研究肿瘤的良好体外模型，也可用于靶点的验证和靶点药物疗效的评估。
3.研究肿瘤异质性和肿瘤进化
肿瘤异质性包括同一种肿瘤在不同患者间或同一患者体内不同部位肿瘤在细胞基因型及表型上存在的差异，是肿瘤患者疗效存在差异的主要原因。其中，同一患者体内肿瘤还包括不同位置肿瘤的瘤间异质性以及同一肿瘤病灶的瘤内异质性。
2D的细胞系在长期培养中会逐渐丢失原位肿瘤的异质性，适应了培养环境的细胞克隆才能存活，无法较好模拟肿瘤异质性。而3D培养的肿瘤类器官能够在体外较好保留肿瘤异质性。即使同一患者肿瘤类器官中，也能观察到形状、大小及增殖能力不同的类器官。肿瘤类器官生物库建立后，不同患者肿瘤类器官株可用于探究不同患者间的肿瘤异质性和对不同治疗的反应异质性；来源于同一患者不同部位（原发灶及转移灶）的肿瘤类器官可用于研究同一患者体内的瘤间异质性及对治疗的反应异质性；来源于同一患者同一部位的肿瘤类器官联合单细胞组学测序技术能够用于探究同一病灶内部不同肿瘤细胞亚群的异质性，联合流式细胞分选技术还能将不同肿瘤细胞亚群分离，并进行药物敏感性测试。Suet Yi Leung团队建立了原发性胃癌类器官生物库（n＝63），其中包含来自34名胃癌患者的正常、异常增生、胃癌和淋巴结转移灶类器官，通过详细全外显子组和转录组分析后揭示了不同胃癌患者的肿瘤异质性及同一患者不同病灶的瘤间异质性［12］。Jarno Drost团队建立了54例儿童肾肿瘤类器官生物库，并且结合单细胞转录组测序揭示了来源自Wilms肿瘤的类器官由多种不同的细胞类型组成，包括上皮细胞、间质细胞和类胚细胞，此外，该研究显示了不同儿童肾肿瘤（Wilms肿瘤、肾透明细胞癌、肾脏恶性横纹肌样瘤）的异质性，为基础癌症研究、药物筛选和个性化医疗提供了具有代表性的模型［19］。
此外，肿瘤类器官联合全外显子测序或者单细胞转录组测序也是探究肿瘤进化的主要方法。同一患者治疗前后的肿瘤类器官在经过全外显子测序或者单细胞转录组测序后能够描述不同细胞亚群的进化过程，为我们进一步了解和分析耐药或者药物敏感细胞亚群提供帮助。
4.模拟肿瘤微环境(https://www.daowen.com)
随着免疫治疗在多种肿瘤治疗中占据越来越重要的地位，亟须较好的体外模型模拟患者特异性肿瘤微环境，并且预测对免疫治疗及部分靶向间质或血管内皮细胞药物的疗效。在普通肿瘤类器官提取和基质胶普通培养的方式下，肿瘤类器官只包括肿瘤细胞成分，缺乏间质成分和免疫微环境，需要与成纤维细胞等间质细胞、血管内皮细胞或免疫细胞进行共培养才能用于探究相关靶点的疗效。
目前模拟肿瘤微环境的方法包括以下两种：整体法和还原法。整体法指将包含所有肿瘤细胞类型的肿瘤组织小块作为整体在气液界面中培养，其中包括内源性免疫细胞和其他非上皮细胞类型，虽然随着培养时间的延长，体系中免疫细胞的含量逐渐减少，但在培养基中加入IL-2的情况下免疫细胞可以保留30天以上，且在类器官传代后还有一定程度的保留，该模型可用于模拟体内肿瘤微环境，可用于评价免疫检查点抑制剂（immune checkpoint blockade，ICB）疗效。此外，前述的微小类器官球体（MOSs）模型能够保留髓系和淋系免疫细胞，可用于评估免疫检查点抑制剂及细胞免疫治疗的疗效［27］。
还原法指建立肿瘤类器官株后，与来自同一患者外周血、淋巴结淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等自体免疫细胞共同培养，并外源性添加IL-2、IFN-γ、CD28等因子以促进肿瘤反应性淋巴细胞的连续扩增，该模型可以用于评估免疫检查点抑制剂疗效或者细胞免疫治疗疗效。Emile Voest团队建立了错配修复缺陷型结直肠癌和非小细胞肺癌类器官，并证明肿瘤类器官和外周血淋巴细胞的共培养能够富集肿瘤反应性T细胞，这些T细胞可用于评估对患者肿瘤类器官的杀伤效率，该研究还提供了一种方法来评估肿瘤细胞对T细胞介导的细胞杀伤的敏感性［104］。
此外，微流控系统和3D打印在肿瘤类器官领域的应用和推广进一步促进了肿瘤类器官模型模拟肿瘤微环境的进程，使得肿瘤类器官模型能够在体外预测免疫治疗和靶向免疫微环境其他治疗的疗效。
5.肿瘤耐药机制探索
肿瘤耐药包括对治疗最初不敏感的原发性耐药以及治疗后逐渐对原来敏感治疗耐药的继发性耐药。目前，在体外模拟肿瘤患者原发性耐药和继发性耐药均缺乏稳健的模型。2D细胞系在体外长期培养过程中无法维持原有肿瘤的异质性；PDX模型耗费时间长，成功率不高且费用较高。肿瘤类器官能够较好地在体外模拟原位肿瘤对放化疗、靶向治疗等治疗的耐药性，并能够在体外进行高通量药敏测试和便于进行基因编辑，这些特点使得肿瘤类器官成为研究肿瘤耐药机制的良好体外模型。
多项研究利用肿瘤类器官作为耐药模型来研究耐药具体机制。Casper Eijck团队为研究胰腺癌对新辅助治疗耐药的机制，建立了包括10例胰腺癌类器官的生物库，其中5例患者接受过FOLFIRINOX新辅助化疗，5例患者未接受任何治疗。药敏测试结果显示5例接受过治疗的胰腺癌类器官对FOLFIRNOX及伊立替康单药均耐药，与患者临床耐药情况相似［105］。此外，该研究通过转录组测序发现耐药可能与基因组不稳定性、能量代谢和先天免疫系统的通路相关。Shoji Natsugoe团队从21例口咽和食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织中培养出15例肿瘤类器官，并发现耐药细胞亚群特征为CD44高表达及更强的自噬潜能［57］。
6.前瞻性指导肿瘤患者治疗方案选择
此前大部分肿瘤类器官转化性研究都回顾性分析了患者疗效与类器官药敏的相关性。此外，还有部分与临床试验伴随的肿瘤类器官转化性研究。Nicola Valeri团队的研究中29例转移性胃肠道肿瘤类器官来源于PROSPECT-C/PROSPECT-R/FORMAT/FGFR等临床研究，结果表明肿瘤类器官的紫杉醇、瑞戈非尼和TAS-102敏感性与患者临床疗效相关［11］。Emile Voest团队的转移性结直肠癌类器官转化研究表明肿瘤类器官对伊立替康敏感性与患者临床疗效高度相关（AUC＝0.96）［16］。章真和华国强团队的局部进展期直肠癌类器官转化研究结果表明直肠癌类器官对5-FU、伊立替康、X射线敏感性能够预测患者新辅助治疗的疗效［18］。
虽然前述Emile Voest团队进行的肠癌类器官敏感性前瞻性指导患者靶向药物选择的研究结果为阴性［50］，但由于该研究筛选的药物主要是单个的小分子抑制剂，对于经历过多线治疗的转移性结直肠癌患者来说治疗强度较弱，同时类器官缺乏间质成分和免疫成分，药物敏感性结果可能与体内疗效存在差异。肿瘤类器官前瞻性指导患者治疗方案选择方面还需要更多的研究探索。其他已在https：//clinicaltrials.gov/网站注册的肿瘤类器官前瞻性研究具体见表14-1汇总，目前多项前瞻性研究都在患者招募中，期待这些研究的结果能够推动肿瘤类器官在患者个体化精确治疗指导中的应用。
表14-1 目前肿瘤类器官前瞻性指导患者治疗方案临床研究概况
（续表）
注：ct DNA：circulating tumor DNA，循环肿瘤DNA；TCR-T：T cell receptor-engineered T cell，T细胞受体工程T细胞；数据来源：https：//clinicaltrials.gov/（截止到2023年5月）