14.5.2 肿瘤类器官展望
1.肿瘤类器官模拟肿瘤免疫微环境
类器官最初是指来源于正常组织的体外3D细胞培养模型。它包含干细胞以及分化细胞等多种细胞类型，可在体外重建器官的基本结构和功能［4］。肿瘤类器官能较好地保存原始肿瘤组织的基因型特征和表型特征，并能保留肿瘤细胞的异质性，因此和传统2D肿瘤细胞系相比是一种更加优化的肿瘤研究模型。近年来随着研究的进展，类器官技术在肿瘤研究中也有着越来越广泛的应用。
但使用传统方法时原有肿瘤组织中的基质成分无法保留，因此若想将此种模型用于肿瘤免疫的研究，则需要改进培养方法保留肿瘤组织内原有免疫细胞或者在体系中加入外源性免疫细胞，如图14-5所示。
（1）保留组织中原有免疫细胞
①ALI培养法
图14-5 肿瘤类器官与免疫共培养示意图［112］
气液交互法（ALI）是一种特殊的类器官培养方法。在这种模型中，肿瘤组织被机械性切碎成直径1 mm左右的组织块，不进行酶解消化为单个细胞，直接与基质胶混合后平铺于预包被的transwell小室底部。将transwell小室置于细胞培养皿中，在培养皿和小室之间加入类器官培养基。ALI培养方法可以增加体系中的氧气供应，对于呼吸道、消化道或体表肿瘤来说这种气液交互的培养方式也更能模拟肿瘤本身的生长环境。在ALI模型中，肿瘤细胞可以正常生长并形成肿瘤类器官，类器官可以保留原始肿瘤的病理特征和基因改变，此外肿瘤组织块中原始的免疫细胞等基质成分也可以在一定时间内得到保留。
利用这一方法，James Neal等人建立了结直肠癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌等多种来源的类器官，发现在这些类器官中原有肿瘤组织中的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞得到了保留，且免疫细胞的种类和比例与原有肿瘤存在很高的一致性。虽然随着培养时间的延长免疫细胞的含量逐渐减少，但在培养基中加入IL-2的情况下免疫细胞可以保留30天以上，且在类器官传代后还有一定程度的保留。通过TCR测序发现类器官中保留的T细胞与肿瘤组织中含有的T细胞有较高的相似性。在此模型中加入纳武单抗（nivolumab）药物进行处理发现在部分类器官中加入药物后，T细胞激活的标志物如IFN-γ、GZMB、PRF1明显升高，肿瘤细胞也发生了明显的凋亡，说明此模型可以成功模仿肿瘤免疫治疗的反应过程，有望被应用于患者ICB治疗疗效评估和ICB治疗增敏方法的研究中［34］。
②微流控培养法
微流控技术是指一种控制微小流体（10-9～10-18 L）在微型管道（尺寸为数十到数百微米）中流动的技术［106］。在这种体系中，微型通道的尺寸以及细胞与细胞外液的体积比例与肿瘤微环境中都十分类似，且由于雷诺系数较低体系中的液体以层流的方式流动，使得微流体系统中可溶性因子形成与体内相似的浓度梯度，因此微流控系统是模拟肿瘤微环境的良好模型［107］。将微流控装置和类器官技术相结合，不仅可以通过微流体通道的设计和液体流速的控制，提高类器官的均一性和可控性，还让类器官的高通量生产成为可能，提供了一种高通量集成化的药物筛选方法。
由于微流控装置与在体环境有更高的相似性，肿瘤微环境中原始的免疫细胞及基质成分在此系统中能得到较好的保留。利用微流控系统建立患者和小鼠来源的类器官，发现类器官中可以保留患者或小鼠肿瘤组织中原有的免疫细胞并可以对体外的PD-1单抗治疗产生反应。来自本身对PD-1治疗敏感或耐药肿瘤的类器官在体外可以保持与体内相同的药物反应性［108，109］。此外，沈西凌团队建立的微小类器官球体（MOSs）模型能够保留和原有组织相似的髓系和淋系免疫细胞，免疫抑制相关标志物的表达也和原有肿瘤高度一致，可用于评估免疫检查点抑制剂治疗疗效。该模型还可用于与外源性免疫细胞的共培养，由于MOSs有较小的体积和较大的表面积-容积比，外加的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）都更容易渗透入MOSs与肿瘤细胞发生接触并有效杀死肿瘤细胞，为过继性T细胞治疗的疗效评估提供了有效工具［27］。
（2）引入外源性免疫细胞(https://www.daowen.com)
加入外源性免疫细胞最简便的方式是直接在培养基中加入。免疫细胞分泌细胞因子可能会对肿瘤细胞产生作用，当免疫细胞的迁移趋化能力较强时，也可以进入基质胶与肿瘤细胞直接接触。如在患者来源的神经胶质瘤、成神经细胞瘤以及结直肠癌类器官中加入同患者来源的（刺激激活后的）PBMC，并加入PD-1单抗或其他免疫激活剂也可以观察到T细胞的激活以及对肿瘤细胞的杀伤作用，为个性化筛选潜在的抗肿瘤免疫治疗药物或ICB增敏药物提供了新的平台［110，111］。但这种方法较适用于研究免疫细胞与肿瘤细胞的间接作用，研究直接作用时即使免疫细胞有较强的迁移浸润能力或对基质胶进行稀释，细胞间的接触仍不够充分。且基质胶中的成分可能影响免疫细胞功能，导致非特异性激活等情况。因此，在研究细胞间直接作用时，还可以将培养成熟的类器官从基质胶中分离出来，与免疫细胞一起进行悬浮培养。如Krijn Dijkstra等人将患者来源微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high，MSI-H）的肠癌类器官与非小细胞肺癌类器官与同源外周血PBMCs进行共培养。首先将类器官从基质胶中分离出来并消化为单细胞悬液，用IFNγ处理增加肿瘤细胞表面I类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex-I，MHC-I）分子表达从而促进抗原递呈。同时将从外周血中提取出来的PBMCs用抗CD28和抗PD-1的抗体孵育以提供共刺激信号并抵消因IFNγ处理所导致的PD-L1表达上调。将处理好的类器官单细胞与PBMCs按照一定比例混合并在含有IL-2的T细胞培养基中共培养7天。经过2轮共培养后所获得的T细胞可被对应的类器官激活并对其产生特异性杀伤作用。应用此种方法可以在外周血中富集肿瘤反应性的T细胞并可以在个体水平检测T细胞对肿瘤的杀伤效率，为细胞治疗的优化提供了良好的模型［104］。
2.3D生物打印在肿瘤类器官中应用
3D生物打印作为一项新兴的技术，是将生物单元（细胞/蛋白质/DNA等）和生物材料按照仿生形态学、生物体功能或细胞特定微环境要求用三维打印的技术制造出的具有个性化的体外三维生物结构模型。传统的类器官通过干细胞增殖、分化、自组装而形成，因此在细胞数量、细胞类型比例以及2D形态等方面缺乏控制。而3D生物打印技术通过精准稳定的模型构建，配合多喷头带来的多细胞可控类器官打印，可同时打印细胞外基质、多种细胞成分和细胞生长因子，有效改善类器官的微环境，实现复杂结构的重建，从仿生程度和自动化程度等多方面提升传统类器官的质量，在肿瘤微环境的研究中也有着较大应用潜力。
2020年，Kunyoo Shin团队基于3D打印技术引入了一种被称为组装体的迷你器官的新概念，在结构和功能上对人体组织进行全面仿生。该团队利用生物3D打印技术构造患者特异性的膀胱肿瘤组装体，在这一模型中，肿瘤组装体不仅保持了亲本肿瘤的遗传变化，还引入了肿瘤微环境成分，揭示了肿瘤细胞和基质细胞之间的信号反馈在控制肿瘤可塑性方面发挥着关键的作用［92］。
3.肿瘤类器官与血管化
肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的前提，也与肿瘤耐药表型密切相关。单细胞测序技术表明，包括肿瘤组织在内的器官系统中内皮细胞存在异质性。然而，现有的血管生成模型往往依赖于正常血管内皮细胞，而正常血管内皮细胞与肿瘤血管内皮细胞有显著不同，表现出明显的遗传和代谢特征。此外，个体内差异的存在也要求开发改进的肿瘤血管模型系统，以实现个性化医疗［113］。此前应用最广泛的模型系统是人脐部静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）和真皮微血管内皮细胞（human dermal microvascular endothelial cells，HDMECs）原代二维培养模型，但该模型因为缺乏三维结构不能全面概括肿瘤微环境［113］。
血管化类器官的三维结构能够更接近肿瘤微环境。类器官血管化的方法可以分类分为两类：体外和体内血管化［114］。在体外血管化是指通过与血管内皮细胞共培养的策略。对于体外血管化可分为模板化和自组织方法［115］。模板方法包括针水凝胶成型、祭祀水凝胶板的成型、组装及生物打印［115］。自组织方法指血管内皮细胞和支持细胞在血管生长因子的诱导下形成的血管化类器官。体内血管化指当类器官移植到宿主，血管化过程模仿发生在人体内的天然血管生成的过程［116］。因此，体内血管化移植将更有效地开发功能完整的类器官，更有利于类器官的生存。芯片技术和3D打印技术大大促进了血管化类器官的发展，然而类器官血管化领域还有很多挑战需要实现，如构建全功能、自发灌注的功能性血管，也是未来研究的重点。
4.肿瘤类器官发展方向
肿瘤类器官能够较好保留患者原位肿瘤组织的基因组改变、病理分子特征、转录组特征、对放化疗及靶向治疗、免疫治疗的敏感性以及肿瘤异质性，是研究恶性肿瘤发生发展机制、寻找新的药物靶点、为患者疗效进行预测的良好体外模型。在基础研究方面，肿瘤类器官与CRISPR-Cas9技术的结合为研究肿瘤的发生发展机制奠定了基础。肿瘤类器官与病原微生物的共培养也为探究病原微生物在肿瘤发生发展中的作用提供了较好的模型。尽管缺少肿瘤微环境中的免疫和间质成分，但随着微流控技术以及其他共培养技术的发展，肿瘤类器官也能够被用于探索免疫治疗以及抗血管生成受体抑制剂等作用于免疫成分或间质的药物疗效的探索和新靶点开发、新药疗效的测试等。
此外，肿瘤类器官库的建立与多组学测序的结合为我们研究肿瘤耐药机制和寻找新靶点提供了验证模型和前期数据。在临床研究方面，用肿瘤类器官药物敏感性做临床匹配的研究已经越来越多，并且大多显示出较高的一致性。在未来，类器官药物敏感性或结合其他疗效预测指标做前瞻性治疗指导的研究数量会越来越多，期待这些临床研究能够为肿瘤类器官的转化研究提供更多的依据。
然而，目前肿瘤类器官的提取和培养体系仍没有统一的标准，不同实验室的类器官培养体系可能存在差异。如何做到类器官培养和药敏体系的标准化，期待未来出现更多专业指南标准，以指导肿瘤类器官培养和药物敏感性测试的规范化。此外，肿瘤类器官生物库的应用问题涉及的伦理及法规问题仍比较空白，希望未来更多的相关法规能够规范肿瘤类器官的应用场景，完善当前存在的相关问题。
（章真，华国强，张龙，吕涛）