检测方法及注意事项
目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两大类:一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同,如离子交换色谱法、电泳法等;另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点,如亲和层析法、离子捕获法和免疫法等。
(一)检测方法
1.离子交换色谱法
离子交换色谱法主要包含有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)和手工微柱法。
2.琼脂凝胶电泳法
琼脂凝胶电泳法检测原理是根据血红蛋白的不同结构,所带的电荷情况不同,在琼脂糖凝胶上的电泳迁移速度也不同,Hb及HbA1带正电荷,电泳时向负极移动。
3.等电点聚集法
等电点聚集法检测原理是在含有载体的两性介质的薄板上形成连续稳定的 pH线性梯度,血红蛋白中各组分将移动到各自的等电点pH位置上,然后通过分辨率高的微量光密度仪进行仪扫描分析,便可以精确地对各组分进行定量测定。
4.亲和层析法
亲和层析法检测原理为利用硼酸衍生物与HbA1c分子上的葡萄糖顺位二醇进行可逆性反应,HbA1c通过共价结合凝胶柱,而非糖化血红蛋白会被洗脱下来,分离过后,再用高浓度含糖或含顺位二醇基的多羟基复合物将所结合的糖化血红蛋白置换下来。
5.离子捕获法
离子捕获法又称化学发光法,它是近些年发展起来的新方法,其原理是糖化血红蛋白与其相应的抗体结合后,联以荧光标记物,形成一免疫复合物,通过连接带负电荷的多阴离子复合物,吸附到带有正电荷的纤维表面,经过一系列清洗等步骤后,测定其荧光强度,进而得到糖化血红蛋白的浓度。
6.免疫法
免疫法运用的是单克隆抗体技术,是由英国DAKO公司最早研究发现的,针对血红蛋白的β链N-末端8个氨基酸糖基化的抗原位点,所研发出来的单克隆体,用酶免疫的原理来检测。随着不断研究,已有很多种检测方法,包括胶乳凝集法、免疫比浊法和其他免疫法。(https://www.daowen.com)
7.酶法
酶法利用果糖基缬氨酸氧化酶的反应特性,它能够特异性作用于糖基化的缬氨酸或其小肽,产生H2O2,,然后利用辣根过氧化物酶与H2O2的反应使特定的色原显色。
(二)注意事项
(1)HbA1c检测无须空腹,不受进食影响,任意时间均可。
(2)患有血红蛋白异常性疾病的病人,糖化血红蛋白的检测结果是不可靠的,应以空腹和餐后血糖为准。
(3)标准的糖化血红蛋白正常值为4.0%~6.0%。治疗初期,每3个月监测1次,达标后可以每6个月监测1次。
(三)参考值及临床意义
(1)参考值:糖化血红蛋白正常值为4.0%~6.0%。
(2)临床意义:
①可反映患者近2~3个月平均血糖水平。
②可用于预测糖尿病慢性并发症的发生风险。
③糖化血红蛋白≥6.5%可作为糖尿病的诊断标准。
④可用于与应激性高血糖的鉴别诊断。